低溫解除牡丹休眠的組織學(xué)及PsSERK1基因的表達(dá)模式研究.pdf

1、牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，是繁榮昌盛、和平幸福的象征。自古以來(lái)有“花中之王”、“國(guó)色天香”、“富貴花”的美譽(yù)。春節(jié)催花是牡丹產(chǎn)業(yè)的主要內(nèi)容之一，傳統(tǒng)催花不良甚至催花失敗的現(xiàn)象常有發(fā)生。理解休眠解除調(diào)控機(jī)理是完善催花技術(shù)、解決生產(chǎn)中存在問(wèn)題的理論基礎(chǔ)。黃鑫等通過(guò)差異文庫(kù)篩選得到PsSERK1基因的部分cDNA片段，并推測(cè)在低溫解除牡丹休眠過(guò)程中可能參與花芽分生組織分裂活動(dòng)和花器官形成有關(guān)。闡

2、明PsSERK1基因在低溫解除休眠中的生物學(xué)功能，對(duì)深入理解低溫解除休眠的分子機(jī)制具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)選用山東菏澤牡丹基地4年生牡丹品種‘魯荷紅’（PaeoniasuffruticosaAndr.‘Luhehong’）的健壯植株，以4℃冷庫(kù)處理作為低溫環(huán)境，分為五個(gè)低溫處理，低溫0d作為對(duì)照。本研究采用蘇木精石蠟組織切片技術(shù)觀察組織細(xì)胞變化，擬克隆PsSERK1基因后得到該基因全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)其功能，采用North

3、en雜交、定量PCR分析PsSERK1基因表達(dá)規(guī)律，結(jié)合組織學(xué)的研究探討其可能功能，進(jìn)而為探討PsSERK1基因在牡丹花芽休眠解除中分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.未感受低溫的牡丹花芽，不能萌動(dòng)、開(kāi)花;低溫處理5d的牡丹花芽，萌動(dòng)率較低，仍然不能開(kāi)花;低溫處理10d的牡丹花芽，花芽萌動(dòng)率，成花率較低;低溫15d的牡丹花芽，成花率，萌動(dòng)率較高，此時(shí)休眠基本解除;低溫23d的牡丹花芽萌動(dòng)率，成花率最高，休眠完全解除。

4、
　　 2.通過(guò)對(duì)牡丹休眠解除解除過(guò)程花芽進(jìn)行切片處理，各個(gè)原基細(xì)胞不斷進(jìn)行平周、垂周分裂從而使花瓣原基向內(nèi)伸長(zhǎng)、增粗;雄蕊原基在低溫10d后開(kāi)始柱狀伸長(zhǎng)生長(zhǎng);雌蕊原基在低溫處理10d的時(shí)候已經(jīng)分化完成，低溫處理23d的時(shí)候，向上突起呈圓丘狀。各原基細(xì)胞分裂頻率隨著低溫處理時(shí)間的累加，存在差異顯著變化，低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分裂頻率越高，休眠解除的越快。
　　 3.按照RACE試劑盒設(shè)計(jì)引物的要求和已知中間片段序列，設(shè)計(jì)

5、了兩個(gè)特異性引物，分別從5'和3'端采用RACE-PCR技術(shù)擴(kuò)增到目的片段，將片段連接pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)HindⅢ/BamHⅠ雙酶切鑒定，證明克隆片段已經(jīng)插入pMD18-T載體。測(cè)定了兩個(gè)克隆片段序列，然后根據(jù)已知目的片段序列，通過(guò)拼接得到PsSERK1基因全長(zhǎng)序列。PsSERK1基因全長(zhǎng)序列2864bp。其中，5'非編碼區(qū)(UTR)為714bp，3'UTR為313bp和28個(gè)堿基的poly(A)尾，并且含有一個(gè)完整

6、的ORF為1794bp，編碼598個(gè)氨基酸。同源性分析得出，與PsPSERK1同源性最高的物種是葡萄（Htisvinifera），同源性達(dá)95％。
　　 4.采用Northen雜交、熒光定量PCR相結(jié)合技術(shù)，PsSERK1基因在休眠解除過(guò)程中表達(dá)規(guī)律，在五個(gè)低溫處理的不同時(shí)期，PsSERK1基因在RNA水平上的變化趨勢(shì)是低溫初期表達(dá)量增加，低溫10d其表達(dá)量達(dá)到最大值，而后其相對(duì)表達(dá)量降低。推測(cè)PsSERK1基因上調(diào)表達(dá)促進(jìn)了內(nèi)