燦爛弧菌的鑒定及溶血素檢測.pdf

1、海水養(yǎng)殖動物的弧菌病(Vibrio)是一種流行范圍廣，危害嚴重的傳染性疾病。其中燦爛弧菌是致病菌之一。燦爛弧菌是海水動物的重要致病菌，可引發(fā)大菱鲆、牙鲆、大西洋鮭、鱒魚、鱸魚等患多種疾病，可引起尾部有出血點，皮膚腐爛，嚴重的形成潰瘍；背鰭、胸鰭、尾鰭的鰭條基部充血；肝臟腫大，糜爛；腎臟糜爛等癥狀。還可引起刺參腐皮綜合征。弧菌溶血素被認為是主要的致病因子之一。但是，針對于燦爛弧菌致病因子的相關(guān)研究報道較少。國外曾有針對燦爛弧菌的金屬蛋白酶

2、缺失自殺載體的試驗研究報道，但以燦爛弧菌的溶血素基因4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase（4HPPD）為對象的研究尚未見報道。本研究以純化的燦爛弧菌外毒素和燦爛弧菌溶血素基因4HPPD原核表達蛋白為對象，以此菌致病的致病因子進行了分析。獲得的結(jié)果如下：
　　 ⑴青島某美國紅魚養(yǎng)殖場中患潰爛癥的美國紅魚分離到優(yōu)勢菌株QD-1，人工感染實驗證實該菌為美國紅魚的致病菌。對該細菌進行了形態(tài)學、生理生化特

3、性分析，同時對菌株QD-1進行了分子生物學的鑒定，命名為燦爛弧菌QD-1菌株（Vibrio splendidus QD-1）。
　　 ⑵細菌致病性的檢測：溶血性測定：將脫纖維羊血按5％的體積加入Zobell 2216E海洋培養(yǎng)基中制成羊鮮血平板,28 ℃過夜培養(yǎng)。菌落周圍出現(xiàn)半徑為2mm溶血環(huán)。磷脂酶活性測定：配制Zobell 2216E固體培養(yǎng)基,加入體積分數(shù)為1％的新鮮蛋黃,制成平板。在菌落周圍出現(xiàn)半徑為0.5mm乳白色半透

4、明圈。從以上兩個實驗中可以看到燦爛弧菌的溶血性較強，而磷脂酶的活性測較弱，這可能是與菌株的不同有關(guān)。人工感染實驗:在水族箱中，每箱放養(yǎng)健康孔雀魚10尾。致病性試驗共分6組，5個實驗組和1個對照組，每組10尾魚，實驗組的細菌濃度分別為2×104 cfu/mL,2×105 cfu/mL,2×106 cfu/mL,2×107 cfu/mL,2×108 cfu/mL，對照組為0.65％的滅菌生理鹽水，采用腹腔注射，注射劑量0.20 mL/尾。飼

5、養(yǎng)水溫27.4 ℃-28 ℃，連續(xù)觀察7 d，隨時記錄魚的發(fā)病癥狀及死亡情況。應用簡易Korbor's法計算出LD50為 5.62×105 cfu/mL。
　　 ⑶燦爛弧菌挑取單個菌落接種50mL海水培養(yǎng)基中，于28℃增菌18h后，再按1％量轉(zhuǎn)種至1L海水培養(yǎng)基中,200rpm，振蕩48h。硫酸銨沉淀：培養(yǎng)物經(jīng)離心取上清加入固體硫酸銨至70％的飽和度，離心后用濃度為50mmol/L的Tris-HCL(pH=7.8)緩沖液溶解，用

6、相同緩沖液4℃透析48h,將其濃縮后即為粗提外毒素。Sephadex-G100層析：粗提外毒素加入Sephadex-G100層析柱中，用緩沖液洗脫，流速為6滴/min,每2mL收集一管,測定OD值，將最高峰值處的蛋白收集液，用PEG-100濃縮，即為純化外毒素。經(jīng)SDS-PAGE法測得分子量為40.7 kD。通過考馬斯亮藍法測得純化蛋白的含量為0.8 mg/mL。取提純?nèi)苎刈髟海?0，100,1000倍稀釋后無菌過濾,分四組。每一稀

7、釋度腹腔注射孔雀魚5尾,每尾注射0.1mL，室溫觀察48h，記錄實驗魚死亡數(shù)，按簡易Korbor's法計算LD50為6.35 μg。結(jié)果表明，這是一株有致病性的燦爛弧菌。
　　 ⑷將溶血素基因4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(4HPPD)構(gòu)建于表達載體pGEX-6P-I，經(jīng)過一系列的條件摸索后，最終確定加入IPTG至終濃度0.8mmol/L,30℃,200rpm，振蕩4h為最佳誘導條件。將純

8、化的重組蛋白免疫小鼠制備多抗，將QD-1菌株純化外毒素抗原稀釋至16ug/mL，抗體稀釋160倍測得P/N比值最大（陽性血清OD值為0.591，陰性對照值為0.058）。P/N=10。通過間接ELISA測定，免疫小鼠抗溶血素抗體滴度為1:3200。中和溶血素試驗根據(jù)，將溶血素無菌過濾后分別分成10,100倍稀釋組和純化溶血素原液組，分別與20倍稀釋免疫小鼠血清等量混合，室溫作用1h。接種混合物的孔雀魚，原液組全部死亡，10倍稀釋抗原組死