BYDVs編碼的兩種抑制子及其作用機制研究.pdf

1、由大麥黃矮病毒(Barleyyellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麥黃矮病在世界范圍內廣泛發(fā)生,在我國小麥產區(qū)間隙性大發(fā)生,威脅小麥的生產。為最終達到防治該病害的目的,各國的科學家們對大麥黃矮病毒的基因表達、進化、傳播介體與寄主的相互作用等方面開展了深入的基礎研究。篩選鑒定出BYDVs基因組中可能存在的沉默抑制子,可為研究BYDV基因與寄主的互作提供新的證據。
　　 本實驗室已經初步鑒定出BYDV-GAV

2、的ORF6和BYDV-GPV的P0在局部侵染中具有沉默抑制子活性。在已構建好的質粒載體中篩選出pGD-GPV-P0、pGD-GPV-CP、pGD-GPV-MP、pBin-GAV-CP、pBin-GAV-ORF1和pBin-GAV-ORF6共6個蛋白基因的重組載體,為增加實驗的嚴謹性,本實驗新構建了pGO—GPV-UTR—P0重組載體；其次實驗通過重復沉默表型觀察證明了GPV的P0和GAV的ORF6在局部侵染中確實具有抑制子活性。隨后采用

3、半定量PCR對浸潤區(qū)GFP的mRNA水平進行了檢測,發(fā)現強抑制子蛋白HC-Pro與pBin-mGFP5-ER共同浸潤本生煙后,浸潤區(qū)GFP的mRNA水平明顯比pBin-GAV-ORF6或pGD—GPV-P0與pBin-mGFP5-ER共浸潤葉片后GFP mRNA的積累水平要高,其中接種pGD-GPV-P0與pBin-mGFP5-ER共浸潤葉片后GFP mRNA的積累水平比pBin-GAV-ORF6與pBin-mGFP5-ER的積累水平高

4、。而作為RNA定量標準的內參基因EF-1-α的mRNA水平在不同浸潤組合的植株中都是相同的。結果表明GAV-ORF6抑制子的活性比GPV-P0弱。GFP蛋白的Western blot和GFP mRNA、siRNA的Northern blot分析結果進一步證實了GPV-P0與GAV-ORF6表現出的抑制子活性的差異。雖然GPV-P0、GAV-ORF6的表達與陽性對照HC-Pro一樣,能夠增加GFP蛋白的表達量和GFP mRNA的累積量,進

5、而增強GFP熒光,但從實驗可以看出GPV-P0這種抑制子的GFP蛋白的表達量以及GFP mRNA的累積量明顯高于GAV-ORF6。表明GPV-P0是抑制子而GAV-ORF6是弱抑制子。另外,分別將pGD-GPV-P0、pBin-GAV-ORF6與含GFP的植物表達載體pBin-mGFP5-ER對四葉期轉基因煙草16c植株共浸潤,并以HC-Pro作為對照。在侵染16天后對非浸潤葉片進行了Northern blot檢測,也證明GPV的P0、

6、GAV的ORF6與PVY的HC-Pro一樣能抑制由GFP正單鏈RNA引起的系統(tǒng)性基因沉默。
　　 此外,為研究BYDV的基因組結構中基因突變(插入、缺失、重復等)對病毒復制和表達策略的影響、驗證病毒的蛋白功能以及確定重要功能結構域,建立BYDVs侵染性cDNA克隆技術平臺尤為重要。本文以PAV-06KMl4分離物為對象,成功構建了pTCK303-06KM14(ubi啟動子控制下)和pGD-06KM14全長基因組侵染性克隆載體,分