利用轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體表達(dá)重組植酸酶(rphyA)的研究.pdf

1、植酸酶(phytase)能夠催化植酸及其鹽類水解生成肌醇和無機(jī)磷酸(鹽),在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛用作飼料添加劑,以提高畜禽(主要為單胃動(dòng)物)對飼料中磷源的有效吸收和利用,節(jié)省不可再生無機(jī)磷資源的過度消耗,減輕畜禽糞磷對環(huán)境的污染等。目前飼用重組植酸酶的獲得主要利用大腸桿菌和酵母發(fā)酵系統(tǒng)等來生產(chǎn),并已成功進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
　　 家蠶是著名經(jīng)濟(jì)昆蟲,自馴化至今主要被用于取絲織綢。隨著現(xiàn)代生物科技的發(fā)展,家蠶又以其強(qiáng)大的蛋白質(zhì)合成能力

2、和獨(dú)特優(yōu)勢,在生物反應(yīng)器領(lǐng)域備受青睞。家蠶脂肪體具有高效的蛋白質(zhì)合成能力,尤其在五齡中后期至化蛹這段時(shí)間內(nèi),其脂肪體非常發(fā)達(dá),約占體重的30%。如果按一頭蠶(五齡盛食期)平均體重為5g計(jì)算,其脂肪體蛋白含量最高可達(dá)1.5g左右,如利用其生產(chǎn)外源蛋白,有望成為繼絲腺之后又一具重大開發(fā)潛力的新型昆蟲生物反應(yīng)器。
　　 前期研究中,我們克隆了家蠶30K蛋白家族成員BmLP3基因的啟動(dòng)子元件,并于個(gè)體水平證實(shí)其能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在脂肪體中

3、的特異高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,本研究以具有高酶活特性的phyA基因?yàn)榘袠?biāo),構(gòu)建由BmLP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的piggyBae轉(zhuǎn)座表達(dá)載體,經(jīng)顯微注射獲得phyA轉(zhuǎn)基因蠶,并分別進(jìn)行分子檢測及酶活測定,以探索利用轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體生產(chǎn)重組植酸酶等功能性外源蛋白的可行性。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1,phyA基因的亞克隆和表達(dá)載體構(gòu)建
　　 以來源于黑曲霉的植酸酶基因序列(NCBIAccession:No.P34752)為基礎(chǔ),根據(jù)家

4、蠶密碼子進(jìn)行優(yōu)化后直接合成新基因phyA。以合成的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,克隆到pSL[BmLP3-DsRed-SV40]的質(zhì)粒載體中,得到pSL[BmLP3-phyA-SV40];將phyA表達(dá)盒克隆至piggyBac基礎(chǔ)載體pBac[3xp3-DsRed],構(gòu)建成以脂肪體BmLP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac[3xp3-DsRed,BmLP3-phyA-SV40]。
　　 2,植酸酶轉(zhuǎn)基因蠶的獲得
　　

5、 將pBac[3xp3-DsRed,BmLP3-phyA-SV40]載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pHA3PIG按摩爾比1:1混合至濃度為400ng/μL,注射家蠶實(shí)用品種“兩廣2號”母種“7532”早期胚胎,在G1代胚胎期第5-7天置于熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光篩選。從注射了BmLP3-phyA的8個(gè)蛾圈中篩選得到含陽性個(gè)體的蛾圈2個(gè),陽性蛾圈率為25%,選擇一個(gè)蛾圈飼育并進(jìn)行后續(xù)分析和檢測。
　　 3,轉(zhuǎn)基因蠶的分子檢測
　　 提取B

6、mLP3-phyA轉(zhuǎn)基因系G2代蠶蛾基因組DNA,分別進(jìn)行Southern雜交和反向PCR檢測。結(jié)果顯示:該轉(zhuǎn)基因系有目的基因插入且為單拷貝,轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)位于第14號染色體。提取BmLP3-phyA轉(zhuǎn)基因系G2代組織的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qPCR檢測顯示,phyA基因在脂肪體中高量轉(zhuǎn)錄表達(dá),且與內(nèi)源BmLP3的表達(dá)模式基本一致,上蔟前后表達(dá)量達(dá)到最高。
　　 4,rphyA抗體制備和蛋白檢測
　　 將原核表達(dá)

7、的rphyA蛋白經(jīng)鎳柱純化、切膠回收和透析超濾后,獲得單一的蛋白,通過免疫家兔的方式制備了phyA基因多克隆抗體。利用SDS-PAGE和Westernblotting檢測轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體中rphyA蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:未經(jīng)純化的樣品在SDS-PAGE和Westernblotting中均難以看到明顯的信號,經(jīng)鎳柱純化后的樣品則可檢測到rphyA雜交信號。
　　 5,rphyA活性測定
　　 取化蛹后2天的轉(zhuǎn)基因蠶脂肪