ChTLR15基因的多態(tài)性和脾臟中的表達水平與腸炎沙門氏菌感染的相關性研究.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是當前養(yǎng)禽業(yè)較為普遍且不易受重視的食物源性病原菌,成年雞表現(xiàn)為隱性感染且長期排菌,容易為生產(chǎn)所忽視,對禽類生產(chǎn)造成的直接和間接經(jīng)濟損失無法估量,而且對人類的身體健康也造成很嚴重的危害。從長遠發(fā)展考慮,尋求一種全新的預防與控制策略,采用遺傳學方法,培育出抗病新品種(品系),從遺傳素質上永久性地提高雞群對腸炎沙門氏菌的抵抗能力,培育高效、優(yōu)質、抗性雞種是實現(xiàn)養(yǎng)禽業(yè)可持續(xù)發(fā)展的

2、迫切需要。
　　 一直以來,遺傳學家和免疫學家都推崇“基因決定動物抗性學說”,即一些動物傳染性疾病的發(fā)病機制與動物本身的遺傳背景有關,可能受單個或多個抗性基因控制,亦即動物可能對一些傳染性疾病存在完全或部分抵抗力。宿主的遺傳背景對SE的抗性有著深遠的影響,探索相關基因的差異表達規(guī)律是研究雞對SE抗性的必要途徑。因此必須立足于基本,對國內地方雞種腸炎沙門氏菌抗性遺傳基礎進行深入研究,是解決國內地方雞種腸炎沙門氏菌病抗病育種的關鍵科

3、學問題。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種先天免疫模式識別受體,可通過識別并結合一種或多種病原相關分子模式,將細胞外抗原識別信息向細胞內傳遞并引發(fā)炎癥反應,其為疾病機制的研究提供了方向,成為目前研究禽類抗病力的重要候選標記基因之一。TLR15是近來發(fā)現(xiàn)的禽類所特有的Toil樣受體,目前的研究和發(fā)現(xiàn)提示雞TLR15(ChTLR15)與雞腸炎沙門氏菌病抗性存在著密切關系,關于ChTLR15在

4、家禽異嗜性粒細胞中的表達水平以及其和家禽抵抗病原微生物的感染能力的關系是最近研究的焦點。宿主的遺傳背景對SE的抗性有著深遠的影響,不同種屬動物的抗性基因對特定病原菌產(chǎn)生毒素的敏感性和引發(fā)的免疫反應類型差異很大,探索相關基因的差異表達規(guī)律足研究雞對SE抗性的必要途徑。
　　 本研究以中國地方雞種存在對腸炎沙門氏菌抗性的遺傳差異為切入點,進行腸炎沙門氏菌攻毒試驗,以模式識別受體相關基因ChTLR15作為研究對象,從mRNA和DNA水

5、平,采用以實時熒光定量PCR為主的基因差異表達分析,結合基因序列多態(tài)性掃描,探討腸炎沙門氏菌攻毒后對中國地方鴆生長早期脾臟TLR15 mRNA表達的影響,為進一步揭示TLR15與雞腸炎沙門氏菌病抗性的相關性和中國地方雞種腸炎沙門氏菌抗病力差異的分子遺傳機理提供科學依據(jù)和技術支撐。本研究分以下三部分:
　　 1清遠麻雞和白耳雞SE天然感染率的比較以及ChTLR15基因多態(tài)性分布與SE感染的關系
　　 本研究以中國地方雞品種

6、清遠麻雞和白耳雞種母雞為研究對象,通過平板凝集試驗對兩個世代進行沙門氏菌自然感染情況的評估,白耳雞和清遠麻雞世代1的雞白痢陰性感染率分別為41.41％和58.82％,世代2的陰性感染率分別為48.83％和66.3％。白耳雞和清遠麻雞世代1腸炎沙門氏菌陰性感染率分別為68.69％和76.47％。結果提示天然感染率的結果相對穩(wěn)定,清遠麻雞對雞白痢和腸炎沙門氏菌的天然感染率均低于白耳雞,提示清遠麻雞的易感性低于白耳雞。通過PCR-SSCP的方

7、法對清遠麻鴆和白耳雞ChTLR15基因僅有的一個外顯子區(qū)域進行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)掃描,共檢測到三個多態(tài)位點,分別為G168A、C726T和A1166G的突變。其中,G168A和C726T為沉默突變,A1166G引起編碼氨基酸由賴氨酸(Lys)變?yōu)榫彼?Arg)。分析三個SNPs基因型頻率和基因頻率分布,發(fā)現(xiàn)G168A在兩個品種間基因型分布無顯著差異(P＞0.05);C726T和A1166G在白耳雞與清遠麻雞基因型分布差異顯著(

8、P＜0.05,P＜0.01)。群體遺傳特性分析發(fā)現(xiàn),G168A位點在白耳雞群中為低度多態(tài)(PIC＜0.25),在清遠麻雞群為中度多態(tài)(0.5＞PIC＞0.25);C726T位點在白耳雞群和清遠麻鴆群為中度多態(tài)(0.5＞PIC＞0.25);在A1166G位點白耳雞達到高度多態(tài)(PIC＞0.5),而清遠麻雞在該位點為低度多態(tài)。分析ChTLR15基因SNP位點的基因型分布與腸炎沙門氏菌感染情況的相關性,發(fā)現(xiàn)白耳雞C726T多態(tài)位點的基因型在感

9、染陽性組和陰性組間的分布差異顯著(x2=8.84,P＜0.05),陰性組BB基因型數(shù)明顯多于陽性組,B(T)等位基因頻率陰性組比陽性組高18％,提示T等位基因可能是抵抗腸炎沙門氏菌感染的有利基因。其它SNP位點在感染陽性組和陰性組間的分布均無顯著差異,提示G168A、C726T(在清遠麻雞中)和A1166G突變位點基因型分布與腸炎沙門氏菌感染無明顯相關。
　　 2清遠麻雞和白耳雞雛雞腸炎沙門氏菌LD50測定以及腸炎沙門氏菌感染對

10、雛雞生長的影響
　　 為評價清遠麻雞和白耳雞對腸炎沙門氏菌的敏感性,先后進行兩次半數(shù)致死量試驗,試驗一未設性別分組,試驗二進行性別分組,將沙門氏菌母源抗體0效價雛雞分別分為一個對照組和四個攻毒組,2日齡時經(jīng)頸部皮下注射途徑分別對各攻毒組雛雞接種106、107、108、109 cfu劑量組的腸炎沙門氏菌,對照組注射PBS。觀察接種后各實驗組雞的臨床變化和死亡情況,進行細菌學鑒定,測定半數(shù)致死量(LD50),試驗一清遠麻雞和白耳雞的

11、LD50的結果分別為5.89×107cfu和1.10×108cfu,試驗二分別為1.29×108 cfu和1.5×108 cfu,其中雄性清遠麻雞和白耳雞LD50分別為3.18×108 cfu和1.29×108 cfu,雌性清遠麻雞和白耳雞LD50分別為4.22×107 cfu和1.79×108cfu。LD50的結果表明兩個雞種對腸炎沙門氏菌病的敏感性在品種和性別間差異不顯著。細菌分離攀定結果顯示,SE在感染雛雞肝、脾、肺、腎和盲腸中均

12、有分布,且經(jīng)鑒定與接種菌株一致,各攻毒組臟器均表現(xiàn)出不同程度的病變。通過LD50結果,選擇100％存活的106cfu劑量組進行攻毒,觀察對照組和攻毒組生長情況,并于第1,3和10天采集脾臟樣本。腸炎沙門氏菌攻毒后,清遠麻雞和白耳雞的增重受到處理和日齡交互效應的顯著影響,在品種內(F197=7.7,P=0.000;F342=16.1,P=0.000)和品種間(F142=7.5,P=0.000;F439=16.8,P=0.000)都差異極顯

13、著。白耳雞在PBS處理后的第1天,對照組體重顯著低于出雛重(P=0.0257),體重呈現(xiàn)負增長,此體重下降可能足由于受到抓捕刺激引起的,在處理后第3天,對照組試驗雞體葦開始正增長,顯著高于出雛重(P=0.0000);而清遠麻雞對照組的體重在試驗時間內一直表現(xiàn)為正增長,這一結果提示清遠麻雞的抗逆能力比白耳雞強。白耳雞在攻毒后的第1天和第3天攻毒組體重均顯著低于出雛重(P=0.0047,0.0003),體重呈現(xiàn)負增長:到攻毒后第8天攻毒組體

14、重才超過出雛重,說明白耳雞攻毒組的生長受到嚴重的阻滯;清遠麻雞攻毒組體重雖然一直低于對照組,但是在攻毒的第1天,攻毒組體重和出雛重沒有差異(P=0.1446),在攻毒后第3天,已經(jīng)顯著高于出雛重(P=0.0000),表現(xiàn)出正增長。攻毒組除了受到抓捕應激外還受到腸炎沙門氏菌攻毒的影響,在攻毒劑量一致和白耳雞的出雛重高于清遠麻雞(P=0.000)的情況下,提示白耳雞比清遠麻雞對腸炎沙門氏菌感染更加敏感。
　　 3ChTLR15 mR

15、NA在脾臟中表達水平的變化與腸炎沙門氏菌感染關系的研究
　　 通過實時熒光定量PCR的方法,比較兩個品種鴆脾臟樣品中攻毒組和對照組(試驗二)ChTLR15 mRNA相對表達量的變化。結果顯示,與對照組相比,在三個時間點兩個品種試驗雞脾臟中ChTLR15 mRNA的表達均顯著上調,其中白耳雞在感染后第1天他和第3天攻毒組ChTLR15的表達均極顯著上調(P=0.003,0.001),清遠雞在感染后三個時間點攻毒組ChTLR15的表

16、達水平均呈現(xiàn)極顯著上調(P=0.016,0.002,0.001)。白耳雞的攻毒組內和清遠麻鴆的攻毒組內ChTLR15的表達在時間上沒有顯著差異,說明在腸炎沙門氏菌感染過程中,脾臟中ChTLR15 mRNA從第1天到第12天表現(xiàn)為持續(xù)的高表達。在攻毒后第1天,清遠麻雞攻毒組的ChTLR15表達顯著低于白耳雞;其他時間點清遠麻雞和白耳雞對照組和攻毒組ChTLR15的mRNA表達沒有差異。綜上所述,ChTLR15基因在雞沙門氏菌感染過程中參與