中國(guó)東部PCV2分子流行病學(xué)與PCVD亞單位疫苗抗原分子研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒病(PCVD)是豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的又一種新的重要傳染病，主要臨床表現(xiàn)包括：斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征( PDNS)、豬呼吸道復(fù)合體病和繁殖障礙等。其中，PMWS對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)影響巨大，主要發(fā)生于5-12周齡豬，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為衰竭、淋巴結(jié)腫大、呼吸困難、貧血、腹瀉，黃疸和皮膚蒼白，并出現(xiàn)免疫抑制，易發(fā)生多病原混合感染，加劇臨床癥狀。
　　 PCV2是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的重要成員

2、，無囊膜?；蚪M為單股環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)1767或1768nt，含3個(gè)主要閱讀框：ORF1、ORF2和ORF3．ORF1編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白；ORF2編碼病毒衣殼蛋白——Cap蛋白，包含多個(gè)線性B細(xì)胞表位和中和表位，能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)；ORF3編碼的蛋白與病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。PCV2可以分為2個(gè)大的基因型：PCV2a和PCV2b。PCV2a包括2A-2E五個(gè)亞型；PCV2b包含1A、1B、1C亞型。很多國(guó)家地區(qū)都已發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)基因型的

3、飄移，且認(rèn)為PCV2b比PCV2a毒力更強(qiáng)。
　　 疫苗免疫是預(yù)防PCVD的有效手段。國(guó)內(nèi)外商品化疫苗主要有滅活疫苗、桿狀病毒Cap蛋白重組亞單位疫苗和PCV1-PCV2嵌合病毒滅活疫苗。本研究對(duì)我國(guó)東部31株P(guān)CV2全基因序列進(jìn)行了分析，明確了PCV2分子流行病學(xué)特征；利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分析了Cap蛋白不同截?cái)啾磉_(dá)產(chǎn)物的抗原特性；構(gòu)建了融合表達(dá)Cap蛋白和生長(zhǎng)抑素的重組大腸桿菌和桿狀病毒，并分別進(jìn)行了免疫特性測(cè)定，為PCV2

4、基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。本研究具體內(nèi)容如下：
　　 1．中國(guó)東部PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查通過臨床病料的檢測(cè)，PMWS的確診，病毒分離，擴(kuò)增獲得2001-2009年間從中國(guó)東部11個(gè)省份發(fā)病豬場(chǎng)分離到的31株P(guān)CV2全基因序列，將其與已公布的另105株中國(guó)東部分離株的序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析．結(jié)果表明這些毒株分屬PCV2b和PCV2a兩個(gè)型，其中PCV2b中有108株屬1A/1B亞型，19株屬1C亞型；PCV2a中有1株屬2A亞

5、型，2株屬2D亞型，6株屬2E亞型。在9個(gè)PCV2a型毒株中，有8個(gè)分離自2005年之前。此外，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)：在Cap蛋白的53-91、121-151和190-210位氨基酸存在三個(gè)高度變異區(qū)；每種亞型具有某些特有的氨基酸變異模式；Cap蛋白上存在一些變異的或保守的抗原表位；同時(shí)在自然條件下存在不同基因型間的重組。以上研究結(jié)果說明在2001-2009年中國(guó)東部地區(qū)PCV2流行毒株存在PCV2a和PCV2b兩個(gè)基因型，同時(shí)存在由PC

6、V2a向PCV2b的漂移現(xiàn)象，這為中國(guó)豬圓環(huán)病毒病的防控提供了依據(jù)。
　　 2．豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白截?cái)啾磉_(dá)及其抗原特性研究分別擴(kuò)增五段不同長(zhǎng)度的Cap蛋白基因克隆入原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白得到成功表達(dá)（Cap-A:51-150aa、Cap-B:51-200aa、Cap-C:51-234aa、Cap-D:101-200aa、Cap-E:101-234aa）。

7、系統(tǒng)的研究不同大小的Cap蛋白亞單位在抗原性方面的差異：將純化的5個(gè)重組蛋白分別包被酶標(biāo)板，利用14份IFA陰性血清和10份IFA陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，結(jié)果為第51-234aa片段(Cap-C)抗原包被組S/N值高于其它4個(gè)片段抗原組。將5個(gè)重組蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，檢測(cè)其抗體產(chǎn)生動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)Cap-C組誘導(dǎo)的抗體水平最高，而Cap-D誘導(dǎo)的反應(yīng)最弱。本研究結(jié)果表明，Cap-C抗原反應(yīng)原性和免疫原性高于其它重組截?cái)嗟鞍?，為P

8、CV2 ELISA抗體檢測(cè)方法和亞單位疫苗研制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 3．豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白原核表達(dá)重組亞單位疫苗免疫保護(hù)效力研究在篩選獲得大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物Cap-C蛋白具有較好免疫原性基礎(chǔ)上，采用ISA206和CP940等4種佐劑配制疫苗，小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，與不加佐劑抗原對(duì)照組相比，4種佐劑均可有效提高Cap重組蛋白誘導(dǎo)的ELISA抗體水平（P>0.05）。采用CP940水佐劑Cap重組亞單位疫苗PCV2滅活疫苗進(jìn)行

9、豬體免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果為：該疫苗經(jīng)兩次免疫可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生較高的ELISA抗體；攻毒后Cap-C免疫組豬和滅活疫苗免疫組豬僅出現(xiàn)短時(shí)間的發(fā)熱，無明顯臨床癥狀，相對(duì)日增重與空白對(duì)照相似（P>0.05），但明顯高于攻毒對(duì)照組(P<0．05)。兩免疫組在病毒血癥、淋巴結(jié)病毒載量、病理學(xué)變化方面相似，但明顯輕于攻毒對(duì)照組。該研究結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)的Cap重組亞單位疫苗對(duì)PCV2感染具有較好免疫保護(hù)作用，有望成為防控PCV2所致相關(guān)疾病的新型候

10、選疫苗。
　　 4．表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap-生長(zhǎng)抑素融合蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定VLPs疫苗是一類新的亞單位疫苗，具有全病毒的結(jié)構(gòu)又不合核酸，更加安全有效，而且它可以作為外源抗原片段或表位的載體，構(gòu)建嵌合疫苗。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)VLPs的常用工具，已有報(bào)道經(jīng)此系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap蛋白可以形成VLPs;生長(zhǎng)抑素(SS)是十四個(gè)氨基酸的小肽，與下丘腦生長(zhǎng)激素釋放因子( GHRF)共同調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素(GH)的釋放，研究表

11、明通過與載體蛋白融合表達(dá)，主動(dòng)免疫動(dòng)物，可使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)SS抗體，中和體內(nèi)SS，解除SS的抑制作用，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。本研究通過PCR的方法擴(kuò)增得到PCV20 RF2基因和在其末端引入SS基因的ORF2-SS基因片段，將其克隆到Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)pFastBacTM HT B載體中，經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定篩選獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pF-Cap和pF-Cap-SS，轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)大腸桿菌中，

12、經(jīng)藍(lán)白菌落篩選和PCR鑒定，獲得重組表達(dá)載體rBac-Cap和rBac-Cap-SS。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rAt-Cap和rAc-Cap-SS，將重組病毒傳代擴(kuò)增。間接免疫熒光和Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目的蛋白BCap和BCap-SS得到正確表達(dá)，表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性；將目的蛋白超離純化，電鏡觀察可以形成病毒樣顆粒(VLPs)．將病毒傳代增殖，空斑試驗(yàn)檢測(cè)重組病毒滴度可達(dá)5

13、×107pfu/mL.
　　 5．桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap-生長(zhǎng)抑素融合重組蛋白亞單位疫苗免疫特性研究將桿狀病毒表達(dá)獲得的重組Cap-SS蛋白(BCap-SS)制備疫苗，評(píng)價(jià)其免疫效果和對(duì)動(dòng)物體增重的影響。小鼠試驗(yàn)結(jié)果為：BCap-SS和BCap兩種重組蛋白均可誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2特異抗體，兩次免疫后ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1:1600，BCap-SS免疫組小鼠增重高于BCap和空白組。豬體試驗(yàn)結(jié)果為：兩次免疫后可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)

14、生較高水平的PCV2特異ELISA抗體(1:1024)；首免后2周和4周，BCap-SS免疫組豬相對(duì)日增重(RDWG)明顯高于其余各組，2周時(shí)血清SS濃度明顯降低，顯示出較好的促增重效果。免疫豬攻毒后，BCap-SS與其它疫苗免疫組僅出現(xiàn)短時(shí)間的發(fā)熱，每組只有1-2頭豬表現(xiàn)出精神稍差，而攻毒對(duì)照組所有豬發(fā)熱時(shí)間較長(zhǎng)，精神沉郁。攻毒后的25天內(nèi)攻毒對(duì)照組RDWG明顯低于其他各組。此外，疫苗免疫組在病毒血癥、淋巴結(jié)病毒載量、病理學(xué)變化方面相

15、似，明顯輕于攻毒對(duì)照組。這表明桿狀病毒表達(dá)的BCap-SS有望成為即可預(yù)防PCVD又可改善生產(chǎn)性能的新型疫苗。
　　 6．大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)PCV2 Cap-生長(zhǎng)抑素融合蛋白重組體構(gòu)建與免疫特性研究將生長(zhǎng)抑素SS基因引入Cap-C編碼基因的末端，克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果表明重組蛋白獲得表達(dá)，經(jīng)包涵體洗滌純化復(fù)性后可得到較高純度的重組蛋白，將純化的重組蛋白Cap-SS制備疫苗，以

16、Cap-C作為對(duì)照進(jìn)行豬體攻毒保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其免疫效果和對(duì)動(dòng)物體增重的影響，結(jié)果為：兩次免疫后可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生較高水平的特異抗體，首免后4周時(shí)，Cap-SS免疫組豬相對(duì)日增重（RDWG）明顯高于其余各組，血清SS水平在2周時(shí)顯著低于其余各組，顯示器其具有較好促增重效果。攻毒后，免疫組僅出現(xiàn)短時(shí)間的發(fā)熱，沒有明顯臨床癥狀。攻毒后的25天內(nèi)攻毒對(duì)照組RDWG明顯低于其他各組。此外，免疫組在病毒血癥、淋巴結(jié)病毒載量、病理學(xué)變化方面相似，明顯輕于

17、攻毒對(duì)照組，證明大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)PCV2 Cap-生長(zhǎng)抑素融合蛋白亞單位疫苗具有較好免疫保護(hù)作用和促生長(zhǎng)作用。
　　 綜上所述，本研究證實(shí)了我國(guó)東部2001-2009年P(guān)CV2流行毒株有PCV2a和PCV2b兩個(gè)基因型，主要為PCV2b，豐富了我國(guó)PCV2分子流行病學(xué)資料。同時(shí)證實(shí)大腸桿菌表達(dá)的Cap蛋白第51-234aa片段具有很好的反應(yīng)原性和免疫原性，并可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。桿狀病毒和大腸桿菌表達(dá)的Cap-SS融合蛋白