豬鏈球菌2型omp40基因功能研究及MRP與豬腦組織互作蛋白的篩選.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種革蘭氏陽性、溶血性兼性厭氧的球菌?？梢鹭i腦膜炎、關節(jié)炎、心內膜炎、支氣管炎、多發(fā)性漿膜炎、腦炎、流產、敗血癥、膿腫及猝死;致人敗血癥、心內膜炎、腦膜炎，感染后遺癥包括失聰和關節(jié)炎，嚴重的致人死亡，是一種重要的人畜共患病病原。根據(jù)其莢膜多糖抗原性的差異，分為33個血清型(1-31，33，1/2)。其中，2型(Streptococcus suis type2，SS2)是毒力最強、危害最

2、嚴重、流行最廣泛的血清型之一。1998年和2005年分別在我國江蘇和四川暴發(fā)大規(guī)模SS2感染豬和人的公共衛(wèi)生事件，臨床上有高比例的病人出現(xiàn)中毒性休克綜合征(STSS)，對養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生均構成嚴重威脅，使得豬鏈球菌感染的相關研究受到高度關注。
　　 盡管致病微生物的致病機理各不相同，但是大部分致病菌致病都是利用粘附和侵襲機制穿透宿主細胞屏障，從而逃避機體清除機制。定植是病原菌致病力的關鍵，在細菌感染并引起疾病的早期發(fā)揮重要作用。

3、病原菌的粘附能力是細菌成功定植的關鍵，黏附素是病原菌重要的毒力因子。鏈球菌的黏附素分為兩大類，其中一類是MSCRAMMS（microbial surface cell recognition adhesion matrix molecule），能夠粘附細胞外基質蛋白(ECM)以及細胞相關的整合素。這類黏附素一般是細胞壁錨定蛋白，含有LPXTG基序。已知的SS2 LPXTG錨定蛋白并不多，omp40和MRP在結構上均屬于此類蛋白。

4、　　 本研究以SS2可能的毒力因子omp40和MRP為研究對象，通過Westernaffinity blot、基因缺失系統(tǒng)以及基因芯片研究了omp40在SS2致病中的作用。構建了豬腦組織cDNA文庫，用酵母雙雜交技術篩選MRP互作的宿主蛋白，以期更深入的了解MRP致病機制。
　　 1豬鏈球菌2型omp40基因的分布及克隆表達
　　 omp40基因是通過抑制性差減雜交（Suppression Subtractive Hy

5、bridization，SSH）方法鑒定的SS2可能的毒力基因，尚待深入研究。本文對omp40基因進行序列分析，克隆表達，并檢測其在31株豬鏈球菌中的分布情況，以期進一步闡明其在SS2致病過程中的作用。結果顯示:omp40開放閱讀框為3000bp，編碼1000aa，含有錨定基序LYXTG。Western blot證實其編碼細菌胞壁蛋白。BLAST結果顯示該蛋白與金黃色葡萄球菌的膠原蛋白結合蛋白Cna有共同的保守區(qū)域。在31株SS2菌株中

6、，除了無毒株T15 omp40 PCR檢測為陰性外，其他從病豬體內分離到的菌株均為陽性，而SS1、SS7、SS9、SS10、SS11、SS12均為陰性。配體印跡結合實驗顯示，omp40蛋白能與人膠原蛋白Ⅰ型結合，提示omp40在SS2的致病過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　 2 omp40基因缺失株、互補株的構建及特性分析
　　 為了進一步研究omp40基因在SS2致病過程中的作用，利用溫度敏感型穿梭自殺質粒pSET4s定點

7、敲除SS2 ZY05719的omp40基因，構建了omp40基因缺失株Δomp40，并通過穿梭載體pSET2構建互補株CΔomp40。比較了各菌株在細胞粘附、生物被膜形成能力、毒力以及肢原蛋白粘附能力的差異。試驗結果顯示，缺失株乖互補株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，缺失株對HEp-2細胞粘附能力下降30％，生物被膜形成能力是野毒株的0.65倍，在斑馬魚的感染模型中，毒力下降了4倍，對人膠原蛋白Ⅰ型的粘附顯著下降，這些數(shù)據(jù)表明omp40與SS2的

8、致病性相關。
　　 3豬鏈球菌2型OMP40介導感染小鼠腦微血管內皮細胞研究
　　 為了更好的了解OMP40在SS2感染過程中的作用，以小鼠腦微血管內皮細胞為研究模型，將SS2菌株ZY05719以及OMP缺失株分別與小鼠腦微血管內皮細胞共孵育，Trizol處理后小鼠全基因組表達譜芯片(Roche NimbleGen)分析。結果顯示，兩組不同處理的細胞中有30個基因的表達出現(xiàn)了差異，對這些基因分析顯示，這些基因分屬于多種功

9、能范疇，包括免疫反應，炎癥反應、信號轉導等。其中，在omp40基因的存在下，部分趨化因子以及炎癥因子的上調使得中性粒細胞趨化，內皮細胞通透性增加，利于細菌透過血腦屏障，表明omp40基因在SS2引發(fā)腦膜炎中起到了一定的作用。
　　 4豬鏈球菌2型纖連蛋白及膠原蛋白結合蛋白的篩選
　　 纖連蛋白及膠原蛋白是宿主體內的生物大分子，細胞外基質(ECM)的重要組成部分，是病原菌粘附作用的底物。將2-DE gels，Western

10、 affinity blot以及MS相結合，對SS2纖連蛋白及膠原蛋白結合蛋白進行篩選。結果顯示:共有8個Collagen結合蛋白及15個Fn結合蛋白在轉印后的PVDF膜上被鑒定出來。其中，有7個蛋白能夠同時結合Collagen及Fn蛋白。SS2纖連蛋白及膠原蛋白結合蛋白的篩選為進一步研究SS2與宿主互作機制奠定了基礎。
　　 5 MRP與豬腦組織互作蛋白的篩選
　　 分離純化豬腦組織mRNA，以5'端生物素標記的Oli

11、go(dT) primer為引物反轉錄后連接3種讀碼框的Adapter，層析柱分級純化，通過BP重組反應分別構建3種讀碼框的cDNA入門文庫，平均滴度為1.662×106 CFU/mL，文庫總容量為6.648×106 CFU，平均插入片段＞1 kb，重組率為94％。將3種讀碼框的cDNA入門文庫擴增后提取質粒，取等量的質粒通過LR重組反應將入門文庫轉換為三框表達文庫，經測定滴度為1.78×106 CFU/mL，文庫總容量為7.12×10

12、7 CFU，重組率為92％，平均插入片段＞1 kb。結果表明所構建的三框cDNA表達文庫具有較高的重組率和庫容量，為進一步酵母雙雜交篩選與SS2毒力因子MRP互作的宿主蛋白奠定基礎。
　　 溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）是SS2重要的毒力因子。利用泛素分離酵母雙雜交系統(tǒng)，以MRP為誘餌蛋白從豬腦組織cDNA文庫中篩選MRP的互作蛋白，探索MRP在SS2致病中的作用。經過誘餌構建、