AtST39在逆境響應(yīng)和AtMPA在花粉發(fā)育中的功能分析.pdf

1、基因芯片顯示番茄細(xì)菌性葉斑病原菌Pseudomonassyringae pv.tomato DC3000(PstDC3000),干旱、冷和鹽等逆境處理及在開花關(guān)鍵基因lfy突變體中都能夠上調(diào)AtST39(At3946110)基因表達(dá);AtMPA(Atlg05577)在擬南芥單核花粉粒向三核花粉發(fā)育的過程中特異性表達(dá)。但是.AtST39參與脅迫和AtMPA在介導(dǎo)花粉發(fā)育的分子機(jī)制知之甚少。我們主要對(duì)AtST39進(jìn)行了探索研究,結(jié)果如下:<

2、br>　　 (1)NCBI數(shù)據(jù)庫顯示YWC基因家族共有185個(gè)蛋白家族成員。經(jīng)蛋白多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)YWC蛋白家族含有三個(gè)高度保守的模體。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)YWC蛋白家族成員可能受到Auxin調(diào)節(jié),具有半胱氨酸內(nèi)切酶水解活性,能與APG6結(jié)構(gòu)域相互作用。AtST39和AtMPA蛋白都含有兩個(gè)未知功能的YWC結(jié)構(gòu)域。
　　 (2)轉(zhuǎn)PAtST39::GUS基因植株GUS染色結(jié)果顯示,AtST39在維管束組織、花粉、子葉和成熟葉中表皮毛

3、表達(dá),同時(shí)在側(cè)根起始區(qū)域特異性表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察35S::AtST39-GFP轉(zhuǎn)基因植株幼苗根部發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,同時(shí)在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)一步確認(rèn)了AtST39蛋白定位在細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。從N端截短的AtST39蛋白35S::AtST39 NIT-GFP和35S::AtST39 N2T-GFP在成熟的根中發(fā)現(xiàn)都定位在細(xì)胞核,說明AtST39蛋白N端不影響其入核。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)AtST39存在兩個(gè)已知的剪切變異體,通過

4、設(shè)計(jì)特異性引物,半定量PCR發(fā)現(xiàn)AtST39還存在一個(gè)新的剪切體。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn),AtST39新的剪切體第一個(gè)內(nèi)含子沒有發(fā)生選擇性剪切。進(jìn)一步研究表明鹽和冷脅迫能提高新的選擇性剪切體基因表達(dá)豐度,提示新的選擇性剪切體參與了鹽和冷脅迫應(yīng)答。
　　 (3)利用三引物法和雙引物法在基因組水平對(duì)Atst39,Atst39h,Atmpa和ufc的T-DNA插入突變體進(jìn)行鑒定,通過RT-PCR鑒定并獲得了AtST39基因T-DNA插入突變體純

5、合體,而atst39h,Atmpa插入突變體鑒定結(jié)果顯示沒有敲除AtST39H和AtMPA。
　　 (4)AtST39過量表達(dá)株系,T-DNA插入突變體純合株系與野生型相比,在鹽和干旱脅迫中表現(xiàn)萌發(fā)率下降。突變體對(duì)干旱脅迫的敏感性可以被內(nèi)源ABA合成抑制劑氟啶酮恢復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)突變體與野生型相比,能夠激活更多的ABA響應(yīng)基因RD29B和RD29A轉(zhuǎn)錄表達(dá),同時(shí)反饋抑制ABA合成關(guān)鍵基因NCED3轉(zhuǎn)錄。首先,熒光定量P

6、CR結(jié)果顯示ABA可以誘導(dǎo)AtST39基因的表達(dá)。其次,ABA處理Atst39突變體,過量表達(dá)株系和野生型時(shí),發(fā)現(xiàn)突變體中的ABA響應(yīng)基因如RD29B和NCED3基因表達(dá)下調(diào),而過量表達(dá)株系能夠迅速上調(diào)RD29B基因表達(dá)。再次,突變體與野生型相比,在不同濃度的ABA處理下,種子萌發(fā)率下降,并且ABA能夠強(qiáng)烈地抑制突變體的主根伸長(zhǎng),下胚軸的伸長(zhǎng)和子葉的生長(zhǎng),這種表型可以通過加入細(xì)胞分裂素和轉(zhuǎn)移到不含ABA的1/2MS培養(yǎng)基中部分恢復(fù)。以上

7、結(jié)果表明AtST39在鹽和干旱脅迫條件下依賴于ABA調(diào)控種子萌發(fā)和非依賴于ABA的信號(hào)途徑來調(diào)控幼苗對(duì)逆境的響應(yīng)。最后,用200gM H2O2處理野生型擬南芥,能夠在1h內(nèi)迅速誘導(dǎo)AtST39基因表達(dá)并達(dá)到最大值,因此,我們推測(cè)AtST39作為ROS信號(hào)分子,負(fù)向調(diào)控脫落酸與細(xì)胞分裂素抑制主根、下胚軸的伸長(zhǎng)和子葉變綠過程。
　　 (5)在pad3,wrky11,和coil-J突變體中的AtST39基因表達(dá)下調(diào),相反npr1中At

8、ST39基因表達(dá)上調(diào)。用P.syringae pv.tomato DC3000處理植株后發(fā)現(xiàn),突變體的病斑與野生型和AtST39過量植株相比,Atst39 T-DNA純合突變體的病斑明顯縮小且突變體接菌后能夠顯著激活病程相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)也能增強(qiáng)PAD3和WRKY11基因表達(dá),表明AtST39在擬南芥響應(yīng)P.syringaepv.tomato DC3000病原菌的過程中起負(fù)向調(diào)控作用。
　　 (6)我們構(gòu)建了原核His-AtS

9、T39融合表達(dá)載體pET28a-AtST39,并對(duì)AtST39蛋白進(jìn)行了BL21(DE3)菌株原核表達(dá),通過優(yōu)化表達(dá)條件,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要以包涵體形式存在,少量存在上清中。
　　 (7)另外,我們對(duì)AtMPA基因表達(dá)模式有初步的探索:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)擬南芥成熟花粉中大量表達(dá)基因AtMPA(Atlg05577)在花粉中特異表達(dá),并且Genevestigator V4提示AtMPA在JA生物合成途徑opr3突變體中基因表達(dá)量顯著下調(diào)。共

10、表達(dá)數(shù)據(jù)庫分析顯示.AtMPA與脂肪酶和果膠酶基因共表達(dá)。PL,ACE啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果表明AtMPA啟動(dòng)子存在花粉特異性表達(dá)元件CARGCW8GA、POLLENlL,ELAT52、根器官特異元件OSE2ROOTNODULE和多個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件,轉(zhuǎn)AturA::GUS植株組織化學(xué)染色進(jìn)一步證實(shí)了AtMPA在成熟花粉粒中大量表達(dá),同時(shí)在子葉葉尖和側(cè)根的起始區(qū)域與伸長(zhǎng)區(qū)特異性表達(dá),這些結(jié)果提示AtMPA可能具有水解活性,并參與JA介導(dǎo)的花粉發(fā)育