玉米異交不親和基因Ga1-S的遺傳定位及其過程的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、玉米(Zea mays L.)異交不親和是玉米自交與正交親和，而反交不親和的一種雌雄配子互作現(xiàn)象。高等植物傳粉受精是一個復(fù)雜的生理生化過程，從花粉粒在柱頭上的識別、吸水、萌發(fā)、穿過柱頭和花絲，到花粉管進(jìn)入子房和胚囊，最后釋放精細(xì)胞并和卵細(xì)胞受精結(jié)合?；ǚ叟c花柱胞間互作調(diào)控細(xì)胞的命運、形態(tài)與遷移模式：花粉與親和柱頭的表皮細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合后，花粉管萌發(fā)穿透柱頭；在花柱傳導(dǎo)束中接受其引導(dǎo)、營養(yǎng)而快速伸長。這些過程通過胞間表面分子的信號交流，起始

2、細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因的表達(dá)。因而花粉與花柱互作過程是研究胞間互作的理想模型。Ga1-S異交不親和突變體，是研究上述過程中基因表達(dá)和調(diào)控的理想材料。目前國內(nèi)外既沒有報道與Ga1-S 緊密連鎖的分子標(biāo)記，也沒有報道Ga1-S的精確遺傳定位，對于玉米花絲轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組的研究也未見報道。
　　 本研究首先觀察花粉與花絲的互作過程，確定玉米Ga1-S異交不親和發(fā)生的組織部位與時期；其次從遺傳學(xué)的角度，利用回交群體構(gòu)建

3、Ga1-S的遺傳圖譜，為Ga1-S的分子標(biāo)記輔助選擇以及最終克隆Ga1-S奠定堅實的基礎(chǔ)；最后通過轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，初步揭示異交不親和的機理。本研究獲得的主要試驗結(jié)果如下：
　　 1.異交不親和的表型鑒定：對401D自交(GG×GG)、401D對W22授粉正交(gg×GG)、W22對401D授粉反交(GG×gg)組合,3個組合每個組合100個植株的結(jié)實情況進(jìn)行定性調(diào)查，結(jié)果表明,401D自交(GG×GG)、正交(gg×G

4、G)兩個組合正常結(jié)實，只有反交(GG×gg)組合沒有籽粒，表明異交不親和基因Ga1-S的遺傳效應(yīng)在近等基因系中一致,401D異交不親和性徹底。利用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明ga1型花粉管在Ga1Ga1型花柱中的伸長受阻，部分花粉管的頂端苯胺藍(lán)染色加深，發(fā)生胼胝質(zhì)積聚、膨大。2小時前，三組合的差異不顯著；2小時后自交與正交花粉管的平均伸長速度為10mm/h；2小時后反交花粉管的平均伸長速度為2.5mm/h，最長至5cm左右；確定玉米Ga1-

5、S基因異交不親和發(fā)生的時間段是授粉后2～10 h，ga1型花粉管能夠在Ga1Ga1型花柱傳導(dǎo)束中伸長，但2 h后與對照相比伸長速率減緩，10 h后與對照差異顯著,20 h后開始部分降解，最終不能達(dá)到花絲基部。
　　 2.構(gòu)建回交群體BC1F1(W22//W22/401D)，通過結(jié)實性調(diào)查進(jìn)行表型鑒定，173個單株中可育的有85株，不育的有88株，統(tǒng)計分析表明符合孟德爾回交群體1：1遺傳分離規(guī)律，進(jìn)一步驗證異交不親和基因Ga1-S

6、為主效顯性單基因；遺傳群體的基因型鑒定，首先利用玉米第4號染色體上現(xiàn)有的SSR標(biāo)記，篩選出5個與Ga1-S連鎖的標(biāo)記，Ga1-S基因初步定位于umc2410與umc1294之間；其次利用生物信息學(xué)工具在初定位區(qū)間內(nèi)的BAC上逐一開發(fā)新的SSR標(biāo)記，最終將玉米異交不親和基因Ga1-S定位于玉米4號染色體短臂標(biāo)記AC184840-2與AC184772-1之間，所有分子標(biāo)記與Ga1-S基因的可能排序為由玉米4號染色體短臂近著絲粒一側(cè)起依次為u

7、mc1682、umc1164、umc1758、umc2410、AC184840-2、Ga1-S、AC184772-1、umc1294。在標(biāo)記AC184840-2與AC184772-1區(qū)段內(nèi)有11 BACs(AC184840，AC194254，AC203042，AC191393，AC184113，AC180823,AC205353，AC214441，AC196002，AC210943，AC184772)。
　　 3.利用高通量測序

8、數(shù)字表達(dá)譜，比較授粉后5小時的自交(GG×GG)與反交(GG×gg)花絲的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，并進(jìn)行了熒光定量RT-PCR的驗證。結(jié)果表明641個基因表達(dá)上調(diào),737個基因表達(dá)下調(diào)；差異基因功能富集于分子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)活性，包括66個基因，其中31個基因表達(dá)上調(diào),35個基因表達(dá)下調(diào)，它們主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運輸、細(xì)胞組織等過程；并從中篩選出17個可能與異交不親和相關(guān)的候選基因，它們包括Mitochondrial carrier-like prot

9、ein、Nucleic acid binding protein、Ubiquitin fusion protein、CIPK-like protein、containing leucine-rich repeat receptor-like protein kinase、RALFprecursor等基因。差異表達(dá)基因的基因組位置信息與遺傳定位區(qū)段相比較分析，結(jié)果表明位于定位區(qū)段的候選轉(zhuǎn)錄本有GRMZM2G113470(9.8M)、GRM

10、ZM2G403636(7.2M)、GRMZM2G456471(6.8M)；這些基因的染色體位置與功能有待于進(jìn)一步研究。
　　 4.利用雙向電泳和質(zhì)譜分析，首先比較研究了授粉后10 h 自交(GG×GG)與反交(GG×gg)母本(GG)花絲蛋白質(zhì)組的特異表達(dá)差異。結(jié)果表明自交與反交母本(GG)花絲蛋白質(zhì)組共檢測到25個差異蛋白質(zhì)點，其中15個在自交中特異表達(dá)，10個在反交中特異表達(dá)；通過MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜測序和MASC

11、OT序列分析，注釋了12個蛋白質(zhì)點；其中自交中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)點11、12、14和異交中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)點18、22、24可能與玉米異交不親和密切相關(guān)。候選蛋白11，功能注釋為玉米的SGNH 脂酶，其反應(yīng)底物很多，如復(fù)合多糖、磷脂、酰基輔酶A 酯等，已有研究表明其參與細(xì)胞壁的角質(zhì)化過程、花粉水化過程、調(diào)節(jié)小穗的發(fā)育、降解細(xì)胞壁多糖促進(jìn)細(xì)胞的生長與伸長。蛋白質(zhì)組與遺傳定位比較分析表明，被注釋的差異蛋白質(zhì)的基因組位置信息與與遺傳定位區(qū)段相比

12、較分析，結(jié)果表明被注釋差異蛋白質(zhì)都不位于定位區(qū)段內(nèi)。
　　 其次比較母本(GG)自交授粉后1 h和2 h的花絲蛋白質(zhì)組的差異。結(jié)果表明:與授粉1 h的蛋白組相比，在授粉2 h后的蛋白組中出現(xiàn)28個差異蛋白點；在玉米花粉與花絲早期的相互作用過程中蛋白質(zhì)組有顯著的變化；其中，6個蛋白質(zhì)點特異表達(dá)，19個蛋白質(zhì)點上調(diào)表達(dá),3個蛋白質(zhì)點下調(diào)表達(dá)；通過MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜測序和MASCOT序列分析，注釋了23個蛋白質(zhì)點，其余5個

13、為未知蛋白；功能分類表明，差異蛋白質(zhì)分別參與細(xì)胞壁合成（21.4％）、防御/抗脅迫（17.9％）、細(xì)胞組織、蛋白命運、蛋白合成、轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞過程。授粉2 h和1 h 相比，蛋白質(zhì)組中大部分差異蛋白呈上調(diào)趨勢，并有特異蛋白質(zhì)出現(xiàn)；分泌型過氧化物酶、膨脹素、果膠甲基化酶抑制蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶與未知蛋白4 可能與玉米花粉與花絲的早期互作密切相關(guān)。
　　 Β-7-膨脹素可能參與松弛柱頭與花柱的細(xì)胞壁，促進(jìn)花粉管的延伸。果膠甲基化酶抑制蛋