水稻紫黑色穎殼Pbh基因的遺傳分析與克隆.pdf

1、本研究利用一個天然的水稻紫黑殼突變體pbh為材料,對成熟時期穎殼中色素的成分和含量進(jìn)行了初步分析,并通過圖位克隆、熒光定量PCR等方法分析和研究了調(diào)控紫黑色穎殼基因以及類黃酮代謝途徑相關(guān)基因在水稻穎殼中的表達(dá)情況,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.紫黑殼突變體(pbh)來源于大田種植的05261和9311雜交組合的高后代群體,是一天然的自發(fā)突變體。該突變體在種子蠟熟期后(開花后20天)穎殼變成紫黑色,之前保持綠色。正在成熟的穗子呈現(xiàn)

2、頂部紫黑色和基部綠色的混合色,到種子完熟期以后所有飽滿的種子完全變成紫黑色穎殼且易落粒。我們利用紫黑色突變體與穎殼顏色正常品種巴利拉雜交(pbhxBallila),構(gòu)建遺傳群體。通過遺傳分析發(fā)現(xiàn)紫黑殼突變體性狀受單顯性基因控制,此外調(diào)查發(fā)現(xiàn)在材料中還存在調(diào)控種子果皮顏色的基因,但與紫黑色穎殼基因不連鎖,兩個性狀可以看作是相互獨(dú)立的基因來分別進(jìn)行研究。而且所有的分離世代中的紫黑殼表型的單株都極易落粒,我們推測在突變體中落粒性狀與紫黑色穎殼

3、性狀可能緊密連鎖,或是由同一個基因決定的多種性狀。與野生型相比,除了紫黑殼突變體穗長略長,千粒重有所增加外,其他農(nóng)藝性狀沒有顯著差別。
　　 2.利用紫外分光光度計法和高效液相色譜法測定野生型和突變體成熟期水稻穎殼中的花青素和原花青素含量和成分的結(jié)果表明,與黃殼野生型材料相比,紫黑色穎殼突變體中可溶性的原花青素含量明顯下降,而不可溶的原花青素水解后產(chǎn)生的花青素含量和成分沒有顯著差別。以原花青素的兩個單體兒茶素和表兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,

4、用反相HPLC測定可溶性原花青素結(jié)果表明,紫黑殼突變體中幾乎不含有表兒茶素或含量極少未檢測出,其它可能屬于原花青素多聚體成分,在同等檢測條件下,峰圖面積也顯著變少,表明原花青素的總含量明顯減少。
　　 3.利用(pbh×Ballila)的F2和F3群體將顯性紫黑殼基因精細(xì)定位在第4染色體長臂端64.9Kb區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間共有12個ORF,通過對該區(qū)段測序發(fā)現(xiàn),ORF1(multidrug resistance protein,命名

5、為OsMRP)的第10外顯子處有一單堿基的突變C→T,造成第1022位的纈氨酸(Ⅴ)變成異亮氨酸(Ⅰ)；此外,ORF11(amino acid transporter family,命名為Bh4-5)的外顯子中有22bp堿基的插入,與最近發(fā)表的Bh4基因?yàn)榈任换?。為了確定控制紫黑色穎殼性狀的基因,我們分別構(gòu)建了OsMRP和Bh4-5兩個基因的互補(bǔ)載體、過表達(dá)載體和干擾載體。但由于實(shí)驗(yàn)材料(親本紫黑殼突變體和黃殼野生型)的愈傷組織易褐化

6、,繼代能力低而難于實(shí)行遺傳轉(zhuǎn)化,尚未得到以黃殼野生型為受體材料的互補(bǔ)和過表達(dá)單株:以紫黑殼突變體為受體材料的干擾單株。僅得到了以麗江新團(tuán)黑谷、日本晴、kitaaki為受體材料的干擾植株,相關(guān)的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。
　　 4.利用熒光定量PCR方法檢測了OsMRP和Bh4-5兩個基因的組織特異性表達(dá)結(jié)果表明,OsMRP在水稻苗期和成熟期均有表達(dá),而且在成熟期的葉和穗部中,突變體的表達(dá)顯著高于野生型。而.Bh4-5基因在成熟期的穗部組織

7、表達(dá)明顯高于其他組織,且突變體中表達(dá)量高于野生型。
　　 5.通過對類黃酮途徑相關(guān)的基因表達(dá)分析的發(fā)現(xiàn),調(diào)控類黃酮物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因OsCHS,OsCHI,OsDFR,OsF3H,OsF3’H,OsGT在成熟期紫黑殼突變體各個組織中表達(dá)上調(diào)；參與類黃酮轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中的基因OsGST、OsAHA10,OsMATE主要是在紫黑穎殼突變體中高表達(dá),但是同一基因在植株的局部組織(葉片或莖)中又以野生型的表達(dá)量較高；基因OsFLS,O

8、sLAC和OsLAR在苗期的野生型與突變體中表達(dá)差異不明顯,在成熟期突變體的葉中OsFLS、OsLAR高于突變體,而莖中卻低于野生型。OsPAL在野生型和突變體中各個組織或時期表達(dá)量都很高,但是差異不顯著,說明這個基因可能沒有受到突變基因的影響。而調(diào)控原花青素前體表兒茶素的合成的OsANR基因在黃殼野生型各個組織的表達(dá)都顯著高于紫黑殼突變體。這些結(jié)果顯示在紫黑殼突變體的原花青素途徑中的主要基因的表達(dá)都受到了影響,因此我們推測紫黑殼突變體

9、可能是一個類黃酮代謝途徑的一個突變體。
　　 6.分析成熟期的水稻穎殼中類黃酮途徑相關(guān)基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),與野生型相比,大部分類黃酮途徑相關(guān)基因OsDFR、OsMRP、OsCHS、OsF3H、OsF3'H、OsAHA10、OsANS、OsGT、OsGST在突變體殼中表達(dá)上調(diào),OsPAL、OsMATE、OsCHI、OsLAC和OsFLS這幾個基因在野生型和突變體中表達(dá)差異不明顯。而與原花青素合成途徑相關(guān)的兩個基因OsLAC和OsAN