大黃素和維生素C對團(tuán)頭魴生長、非特異性免疫以及抗應(yīng)激的影響.pdf

1、大黃素(Emodin)是從中草藥大黃(Rheum officinale Baill)根莖中提取的主要有效成分，具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及清除氧自由基、降血脂、保護(hù)肝臟和免疫調(diào)節(jié)等多種功效。維生素C(Ve)是魚類必需的營養(yǎng)素，兼有免疫增強(qiáng)和抗氧化的雙重功效，但大多數(shù)魚類缺乏合成Ve所需的L古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶(L-gulonolaetone oxidase，GLO)，必須從食物中攝取Vc．為了研究大黃素和高劑量Ve對魚類生長、非特異性

2、免疫以及抗應(yīng)激的影響，選用我國主要淡水養(yǎng)殖魚類之一的團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala，Yih)作為研究對象，首先分離、克隆出團(tuán)頭魴兩種熱休克蛋白70 eDNA的全長序列，并對其基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征進(jìn)行了分析．然后，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了團(tuán)頭魴兩種HSP70s的原核表達(dá)系統(tǒng)，并優(yōu)化了表達(dá)條件，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化和鑒定．同時，選取1200尾健康的團(tuán)頭魴，體質(zhì)量(133.44+2.11)g，隨機(jī)分成4組，其中1組為對照組，投喂

3、基礎(chǔ)日糧(Ve含量50.3 mg/kg)，另外3組為試驗組，投喂飼料是在基礎(chǔ)日糧中分別添加60 mg/kg大黃素、700 mg/kg Ve、60 mg/kg大黃素+700 mg/kg Ve，每組設(shè)3個重復(fù)．連續(xù)投喂60 d后結(jié)束飼養(yǎng)試驗，取魚進(jìn)行擁擠脅迫、高溫應(yīng)激和感染嗜水氣單胞茵的應(yīng)激試驗．1團(tuán)頭魴兩種熱休克蛋白70基因克隆與序列分析
　　 采用RT-PCR和eDNA末端快速擴(kuò)增法(rapid amplification of

4、 eDNA ends，RACE)，分別從室溫和34℃熱激團(tuán)頭魴的肝臟中克隆到兩種熱休克蛋白70基因，分別命名為Ma-HSC70和Ma-HSP70基因．它們的eDNA全長分別為2336和2224 bp[不包括poly(A)]，分別含有1950和1932 bp的開放閱讀框，編碼649和643個氨基酸，分子量約為71.24和70.52kD，理論等電點(diǎn)為5.25和5.30．Ma-HSC70基因在編碼區(qū)含有7段內(nèi)含子，所有內(nèi)含子均遵守GT/AG法

5、則，為組成型HSC70，而Ma-HSP70基因在編碼區(qū)不含內(nèi)含子，為誘導(dǎo)型HSP70．氨基酸序列分析表明，Ma-HSC70和Ma-HSP70均含有HSP70家族的3個簽名序列，兩個部分重疊的雙向核定位信號序列(nuclearlocalization signal sequence，NLS)以及胞質(zhì)的特征基序EEVD等。同源性分析表明，Ma-HSC70與異育銀鯽等脊椎動物HSC70的氨基酸序列相似性高達(dá)93.0％以上，而Ma-HSP70與

6、鯽魚等脊椎動物HSP70氨基酸序列的相似性高達(dá)85.0%以上，它們之間氨基酸序列相似性為86.5%。生物信息學(xué)分析顯示，團(tuán)頭魴兩種HSP70s基因所編碼的蛋白以親水性區(qū)域為主，均具有豐富的B細(xì)胞抗原位點(diǎn)，無信號肽，為非典型的分泌型蛋白，無明顯的跨膜區(qū)域；同時還含有眾多的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)，推測這些位點(diǎn)在蛋白質(zhì)折疊，轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)定位以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控中發(fā)揮重要作用。這兩種

7、蛋白的二級結(jié)構(gòu)均以a-螺旋和無規(guī)卷曲為主，空間結(jié)構(gòu)包括N端ATPase功能域和C端多肽結(jié)合功能域。2大黃素和維生素C對團(tuán)頭魴生長、生理生化指標(biāo)以及兩種HSP70smRNA表達(dá)的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，測定團(tuán)頭魴的生長性能，并采樣檢測魚的肌肉成分、血液和肝臟生化指標(biāo)以及肝臟兩種HSP70s mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對照組相比，大黃素、Vc組顯著提高了魚體增重率和特定生長率，血清中總蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和堿性磷

8、酸酶(AKP)的水平，肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和誘導(dǎo)型HSP70mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平，降低了餌料系數(shù)、死亡率、血清中皮質(zhì)醇(COR)、甘油三酯(TG)以及肝臟丙二醛( MDA)的含量(P<0.05)；配伍組雖然血清中TP、LSZ的含量以及肝臟HSP70 mRNA的水平顯著升高，肝臟MDA的含量也顯著降低(P<0.05)，但均未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用．此外，與對照組相比，大黃素組還顯著提高了團(tuán)頭魴肝臟過氧化氫酶( CAT)的活性

9、（P<0.05），而Vc和配伍組CAT的活性與對照組的差異不顯著（P>0.05）；其它一些指標(biāo)如血清中葡萄糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶( GOT)、膽固醇(CHOL)，肝臟組成型HSC70 mRNA的表達(dá)水平，魚體形體指標(biāo)以及肌肉組成成分等各組之間差異均不顯著（P>0.05）．3大黃素和維生素C對團(tuán)頭魴在擁擠脅迫下的生化指標(biāo)及兩種HSP70smRNA表達(dá)的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從各池中取25尾規(guī)格基本一致

10、的團(tuán)頭魴，進(jìn)行連續(xù)48 h的擁擠脅迫(100g/L)試驗，分別于Oh、12h、24 h、48 h取樣分析團(tuán)頭魴血液和肝臟的生化指標(biāo)以及肝臟兩種HSP70s mRNA的表達(dá)水平，并統(tǒng)計各組魚的累積死亡率。結(jié)果表明，在擁擠脅迫后，與對照組相比，大黃素、Vc組不同程度地提高了團(tuán)頭魴血清中TP和AKP的水平，肝臟中SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表達(dá)水平，降低了血清中COR、GLU，GPT、GOT、TG以及肝臟MDA

11、的水平，而LSZ的活性表現(xiàn)為先下降后升高；配伍組中，這些指標(biāo)雖然有類似以上的變化趨勢，但大多差異不顯著（P>0.05），且同樣未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。此外，各組魚血清CHOL的水平在擁擠脅迫前后的差異均不顯著(p>0.05）。統(tǒng)計表明，大黃素和Vc組魚的累積死亡率在擁擠脅迫24 h、48 h均顯著低于對照組（P<0.05），而配伍組與對照組的差異均不顯著（P>0.05）．4大黃素和維生素C對團(tuán)頭魴在高溫應(yīng)激下的生化指標(biāo)及兩種HSP70sm

12、RNA表達(dá)的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從各池中取25尾規(guī)格基本一致的魚進(jìn)行高溫應(yīng)激(34℃)試驗。取樣檢測團(tuán)頭魴在高溫應(yīng)激前后血液和肝臟的生化指標(biāo)以及肝臟兩種HSP70smRNA的表達(dá)水平，并統(tǒng)計各組魚在高溫應(yīng)激下的累積死亡率，結(jié)果表明，在高溫應(yīng)激后，與對照組相比，大黃素、Vc組不同程度地提高了團(tuán)頭魴血清TP、LSZ和AKP的水平，肝臟SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70mRNAs的表達(dá)水平，降低了血清COR、GLU

13、、GPT、GOT、TG以及肝臟MDA的水平；配伍組中，這些指標(biāo)雖然也有類似以上的變化趨勢，但大多差異不顯著（P>0.05），且未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。此外，各組魚血清膽固醇的含量在高溫應(yīng)激前后的差異均不顯著(P>0.05）。統(tǒng)計表明，在高溫應(yīng)激下，Vc組魚的累積死亡率均顯著低于對照組，大黃素組魚的累積死亡率除6h外，也顯著低于對照組（P<0.05），而配伍組與對照組的差異均不顯著（P>0.05）．5大黃素和維生素C對團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌

14、后的生化指標(biāo)及兩種HSP70s mRNA表達(dá)的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從各池中取15尾團(tuán)頭魴進(jìn)行腹腔注射感染嗜水氣單胞菌試驗，并在攻毒前后采樣檢測團(tuán)頭魴血液和肝臟的生化指標(biāo)以及肝臟兩種HSP70s mRNA的表達(dá)水平；另從各池中取10尾魚進(jìn)行同樣的攻毒試驗，并統(tǒng)計攻毒后魚的累積死亡率．結(jié)果表明，經(jīng)攻毒后，與對照組相比，大黃素、Vc組不同程度地提高了團(tuán)頭魴血清TP、LSZ和AKP的水平，肝臟SOD和CAT的活性以及HSC70和

15、HSP70 mRNAs的表達(dá)水平，降低了血清COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝臟MDA的水平；配伍組中，這些指標(biāo)雖然有類似上述的變化趨勢，但大多與對照組的差異不顯著(P>0.05)，且未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。此外，各組魚血清膽固醇的含量在攻毒前后的差異均不顯著(P>0.05）。統(tǒng)計也表明，經(jīng)攻毒后，大黃素和Vc組魚的累積死亡率在24 h、48 h均顯著低于對照組(P<0.05)，而配伍組魚的累積死亡率與對照組的差異均不顯著(P>0

16、.05)．6團(tuán)頭魴兩種熱休克蛋白70的原核表達(dá)、純化及鑒定
　　 采用PCR方法擴(kuò)增團(tuán)頭魴組成型HSC70和誘導(dǎo)型HSP70基因完整的編碼區(qū)片段，并分別克隆到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，經(jīng)雙酶切和DNA測序鑒定后，將這兩種重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用lmmol/L IPTG在不同溫度及時間下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，建立最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件．采用Ni-NTA His Bind

17、Resins親和層析和DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析對目的蛋白進(jìn)行純化，并進(jìn)行Western-blotting驗證。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了團(tuán)頭魴兩種重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70，表達(dá)融合蛋白的相對分子量均約為72 kD，并能與兔抗人HSP70多抗進(jìn)行特異性結(jié)合，這兩種HSP70s融合蛋白經(jīng)純化后的純度均達(dá)到95%以上，在較高溫度(37℃)下，有利于融合蛋白的

18、快速大量表達(dá)，但易形成包涵體；在較低溫度(25℃)下，有利于融合蛋白的可溶性表達(dá)，但也會降低融合蛋白的表達(dá)速度。綜合各種因素，本實(shí)驗選擇融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分別誘導(dǎo)7h作為可溶性表達(dá)的最佳條件．
　　 總之，本研究首次從團(tuán)頭魴肝臟中克隆到兩種HSP70s基因，并對該基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征進(jìn)行了分析，確定Ma-HSC70基因為組成型，而Ma-HSP70基因為誘導(dǎo)型。在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了團(tuán)頭魴兩