基于SAGE技術(shù)的家蠶雄性幼蟲高溫處理前后差異表達基因篩選及分析.pdf

1、家蠶是重要的絹絲經(jīng)濟昆蟲，具有重大的應(yīng)用和科研價值。研究家蠶幼蟲對高溫逆境環(huán)境的基因表達差異，對于闡明家蠶對高溫的反應(yīng)機制和培育抗高溫家蠶品種具有重要的理論意義。
　　本文以家蠶品種―7532‖雄性為試驗材料，5齡期設(shè)置高溫組和常溫組，解剖家蠶5齡幼蟲餉食24h、72h和熟蠶的脂肪體、絲腺和中腸，提取各時期相關(guān)組織的總RNA，分別以雄性常溫和雄性高溫的各時期的混合組織為材料，運用基因表達系列分析（SAGE）技術(shù)分別構(gòu)建家蠶5齡雄性

2、幼蟲高溫與常溫2個SAGE文庫，并結(jié)合實驗室構(gòu)建的家蠶5齡雌性幼蟲高溫處理前后SAGE文庫，篩選出與性別無關(guān)的差異表達顯著的熱敏感標簽和基因進行了分析。獲得主要結(jié)果如下：
　　1. SAGE文庫的構(gòu)建與分析成功構(gòu)建了家蠶5齡雄性幼蟲高溫處理前后的2個SAGE文庫。對構(gòu)建的雄性常溫和高溫的2個SAGE文庫分析可得，雄性家蠶幼蟲常溫組和高溫組分別有355萬和358萬個原始標簽（tags），通過兩個文庫的分析比較，獲得917個差異顯著的

3、基因，其中經(jīng)高溫處理后上調(diào)的基因有590個、下調(diào)的有327個。隨機選擇了3個基因用RT-PCR的方法驗證SAGE標簽出現(xiàn)的次數(shù)是否和對應(yīng)的基因表達豐度相一致，結(jié)果表明文庫的數(shù)據(jù)是可靠的?；虮倔w論（GO）分析兩個文庫中的差異表達基因的歸類情況，發(fā)現(xiàn)它們分布相似的，說明高溫前后這些基因都參與了類似的生理過程。通過對兩個家蠶 SAGE文庫中917個差異顯著基因的KEGG路徑分析，結(jié)果顯示有804個基因分布到142個KEGG路徑中，并且大部分

4、的路徑和代謝、生物合成和信號傳遞有關(guān)，這有助于鑒定家蠶抗高溫基因以及探究基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。通過結(jié)合5齡雌性幼蟲高溫處理前后兩個SAGE文庫比較分析，篩選差異標簽1876個，其中高溫后下降的標簽955個，高溫后上升的標簽921個，非性別因素高溫敏感性基因318個。其中高溫后上調(diào)基因124個，下調(diào)基因194個。通過對差異基因的GO分析可得在代謝、催化、綁定功能中富集較多。
　　2. GLGI擴增無注釋信息的差異性tag標簽 GLGI技

5、術(shù)是對SAGE文庫中未知基因挖掘的高效方法之一。通過GLGI技術(shù)擴增，理論上可以得到較長核苷酸序列片段在200 bp-1000 bp，實驗中序列片段長度相對短一些。本實驗中選取了18個tag標簽，最終得到13個標簽的延伸序列，其中8個標簽注釋到已知基因，有5個標簽的延長序列沒有匹配到任何基因，這些延伸序列有助于進一步挖掘SAGE文庫中的未知基因。
　　3．2個差異基因的時空表達對分析篩選出的2個具有顯著性差異的基因分別是分別是熱激