蘇云金桿菌高效殺蟲工程菌的構(gòu)建及其伴胞晶體形成機制研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)作為一種環(huán)境友好型生物殺蟲劑，對靶標(biāo)害蟲具有專一的殺蟲活性，因此被廣泛使用于農(nóng)林業(yè)蟲害以及蚊媒傳播疾病的控制。它的殺蟲特性主要來源于在芽胞形成期大量產(chǎn)生的殺蟲活性蛋白。盡管在生態(tài)環(huán)境保護方面具有無可比擬的優(yōu)勢，但Bt生物殺蟲劑的使用仍然落后于合成的化學(xué)農(nóng)藥。對Bt菌株進行遺傳改良，可為發(fā)展新型Bt生物殺蟲劑產(chǎn)品提供更好的技術(shù)與菌種資源。
　　 為獲得毒力更高

2、、殺蟲譜更廣的Bt菌株，進一步擴展Bt殺蟲劑在生物防治上的應(yīng)用，本研究采用分子手段，利用Bt偏愛密碼子優(yōu)化設(shè)計了昆蟲特異的鈣離子通道阻斷劑基因ω-ACTX-Hvla，并進行化學(xué)合成，與殺蟲晶體蛋白基因crylAc3'-端融合，在Bt中進行共表達，并研究了融合蛋白的晶體形成情況和生物活性功能。在Bt殺蟲蛋白基因crylAc的強表達體系調(diào)控下，crylAc、ω-ACTX-Hvla和綠色熒光蛋白基因egfp在Bt無晶體突變株Cry-B中得到了

3、有效的融合表達。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bt融合基因工程菌Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)的單個菌體中形成了2-3個較小的類似伴胞晶體的包涵體，在菌體裂解后仍然是穩(wěn)定的。在對Bt工程菌表達產(chǎn)物進行的免疫雜交分析中，全長166kDa的融合蛋白帶被清晰的檢測到，說明融合基因可以在Bt中進行完整的表達。通過對工程菌發(fā)酵產(chǎn)物進行生物活性測定，發(fā)現(xiàn)融合蛋白晶體對甜菜夜蛾幼蟲的毒力比CrylAc晶體提高了至少5倍，對棉鈴蟲幼蟲也具有很高的毒力且

4、明顯抑制了幼蟲的生長。這些結(jié)果說明，外源殺蟲蛋白可以采取與Cry類內(nèi)毒素C-端融合的方式在Bt中共表達，共同形成伴胞晶體，并至少保留部分殺蟲生物活性。本研究為構(gòu)建具有不同殺蟲特性的融合蛋白以及構(gòu)建高效廣譜的Bt工程菌株奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 目前，研究者們雖然對cry基因的表達調(diào)控已經(jīng)進行了廣泛研究，但由于在細菌活體中觀察Cry蛋白的聚集過程比較困難，缺乏好的檢測手段，因此人們對此類蛋白晶體形成的機制仍然很不清楚。本研究以Bt融

5、合基因工程菌Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)為研究對象，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對芽胞期菌體的蛋白晶體形成過程進行了連續(xù)時間段的觀察。觀察結(jié)果顯示，融合蛋白開始表達時是散布于母細胞內(nèi)的，晶體形成是一個由蛋白分子從分散到逐漸聚集的一個過程，并且蛋白的聚集位點存在極性，靠近菌體兩端。菌體裂解前，融合蛋白形成的晶體顆粒體積達到最大。本研究構(gòu)建的Cry蛋白可視化分析系統(tǒng)在細胞水平上為深入研究殺蟲蛋白晶體的組裝與形成機制提供了非常有用的技

6、術(shù)檢測手段。
　　 通過對Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)和對照菌株Cry-B(1Ac)裂解前的菌體全蛋白做無標(biāo)記定量的shot-gun質(zhì)譜鑒定和蛋白表達差異分析，初步探索了可能參與影響殺蟲蛋白晶體形成的調(diào)控因子。從Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)菌株和Cry-B(1Ac)菌株中分別鑒定到201和138個非冗余蛋白，其中114個為兩菌株共同所有。蛋白功能分類發(fā)現(xiàn)兩個菌株中功能歸于氧化還原類(Oxidation-r

7、eduction)的蛋白數(shù)量所占比例差異很大，說明菌體內(nèi)的氧化還原環(huán)境可能是造成晶體形成差異較大的原因之一。通過蛋白表達差異比較分析，找到了兩菌株中豐度差異較大的共有蛋白和豐度較大的獨有蛋白，如共同作用參與蛋白折疊與組裝的60kDa伴侶蛋白((GroEL)和10kDa伴侶蛋白(GroES)、參與細胞應(yīng)激反應(yīng)的CIp類蛋白酶和催化還原過氧化氫的過氧化氫酶等，均有可能是參與Bt殺蟲蛋白晶體形成的調(diào)控因子。例如同源性較高的GroEL，已經(jīng)有研