蘇云金桿菌高效菌株的篩選及固體發(fā)酵研究.pdf

1、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前應(yīng)用最廣研究最深入的生防微生物。但是Bt制劑在應(yīng)用過程中仍存在殺蟲譜窄、抗逆性差、防治成本偏高等缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用。為了得到具有應(yīng)用潛力的自然菌株，本實(shí)驗(yàn)室利用分子鑒定的方法，前期篩選得到兩株基因型豐富的蘇云金桿菌野生菌株BtCYZ-4和BtS-19，通過基因型分析，預(yù)測其可能為殺蟲廣譜的野生株。本研究利用生物測定方法系統(tǒng)研究了兩菌株對7種常見農(nóng)林害蟲和衛(wèi)生

2、害蟲的毒力及對紫外線和高溫等不良環(huán)境條件的抗逆能力，同時(shí)，對Bt與化學(xué)藥劑的協(xié)同作用方式進(jìn)行了探索實(shí)驗(yàn)。得到了殺蟲譜廣、抗逆性強(qiáng)的BtCYZ-4菌株，為了降低生產(chǎn)成本，對BtCYZ-4菌株的低成本固體發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究；得到以下主要結(jié)果：
　　 1.兩菌株殺蟲廣譜，但因基因型不同對不同害蟲活性表現(xiàn)出差異。
　　 室內(nèi)生物測定結(jié)果表明，BtCYZ-4菌株對粘蟲(Mythimna separata)初孵幼蟲48h的LC5

3、0為6.6×106cells/mL，對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、淡色庫蚊(Culex pipiens paliens)初孵幼蟲和美國白蛾(Hyphantria cunea(Davy)、蘋掌舟蛾(Phalera flavescens)、楊扇舟蛾(Clostera anachoreta)二齡幼蟲72h的LC60分別為4.7×106cells/mL、2.25×105ce

4、lls/mL、2.01×105cells/mL和2.9×106cells/mL、6.6×107cells/mL、1.7×106cells/mL；相同處理的BtS-19菌株對上述害蟲的LC50則依次為3.1×107cells/mL、9.0×106cells/mL、4.1×104cells/mL、3.5×104cells/mL和1.8×105cells/mL1.7×106cells/mL，對楊扇舟蛾活性較差，這兩株菌對美國白蛾、棉鈴蟲、甜菜

5、夜蛾和淡色庫蚊均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的殺蟲活性。BtCYZ-4菌株對粘蟲、棉鈴蟲、楊扇舟蛾和蘋掌舟蛾的活性高于BtS-19菌株，而對美國白蛾、甜菜夜蛾和淡色庫蚊則表現(xiàn)了相反的趨勢。
　　 2.BtCYZ-4菌株抗逆性優(yōu)于BtS-19。
　　 研究了溫度，紫外線處理不同時(shí)間兩菌株對美國白蛾幼蟲活性的變化。分別采用30℃，33℃，37℃，42℃溫度梯度處理及30min，60min，120min，180min，240min和360mi

6、n不同處理時(shí)間，結(jié)果表明兩株菌在高溫處理下，隨著溫度的升高和處理時(shí)間的延長，活性均呈現(xiàn)出下降趨勢。但BtCYZ-4抗高溫的能力明顯高于BtS-19；兩菌株紫外線處理隨著照射時(shí)間的延長，殺蟲活性也均明顯降低，BtCYZ-4經(jīng)紫外線照射6h，二齡美國白蛾幼蟲平均校正死亡率為56.7％，活性降低了40%。BtS-19經(jīng)紫外線照射6小時(shí)，二齡美國白蛾幼蟲平均校正死亡率為13.33%，活性降低了81.67%。說明BtCYZ-4抗紫外線能力明顯高于

7、BtS-19；綜合而言，BtCYZ-4菌株抗逆性優(yōu)于BtS-19，應(yīng)用潛力較大。
　　 3.得到了以玉米淀粉和玉米芯為基質(zhì)的BtCYZ-4菌株低成本固體發(fā)酵配方。
　　 參考LB培養(yǎng)基C源、N源和礦質(zhì)元素的組成及比例，通過單因子優(yōu)化和正交試驗(yàn)，得到了以玉米淀粉為碳源的固體發(fā)酵配方，各成分含量為：玉米淀粉1%、氮源A0.5%、氮源B2%、酵母粉0.1%、K2HPO40.075%、MgSO40.035%、CaCO30.05%

8、。利用此培養(yǎng)基，按照4%接種量，30℃發(fā)酵培養(yǎng)6d，孢子濃度可達(dá)到5×109cells/mL；在上述礦質(zhì)元素含量，接種量，pn不變的情況下，30℃發(fā)酵培養(yǎng)6d，以單一玉米芯為培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)BtCYZ-4菌，含水量為70%時(shí)孢子濃度最大。以玉米芯、氮源A和氮源B為基質(zhì)，按玉米芯7.2g、氮源A3g、氮源B3.2g、蒸餾水23.3g時(shí)孢子濃度最高，可達(dá)到1.6×1010個(gè)/g。上述兩配方發(fā)酵產(chǎn)物濃度優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的固體發(fā)酵水平。
　　

9、 4.蘇云金桿菌BtS-19與高效氯氰菊酯協(xié)同作用方式為Bt預(yù)處理。
　　 采用Bt預(yù)處理及直接混用2種方式施藥，室內(nèi)飼毒法測定了2種藥劑對美國白蛾2齡幼蟲的活性。結(jié)果表明：試蟲先用每mL含1×106個(gè)/mL孢子的BtS-19菌懸液預(yù)處理，1d后再用系列濃度的高效氯氰菊酯處理，其48h的LC50值為0.76mg/L，而未經(jīng)預(yù)處理，僅用高效氯氰菊酯處理48h的LC50值為1.28mg/L；2種處理在高效氯氰菊酯質(zhì)量濃度為2.25