草魚(Ctenopharyngodon idella)白細胞介素-8的克隆與鑒定.pdf

1、目的：白細胞介素8(白介素-8/IL-8)是一個堿基-肝素結(jié)合蛋白，屬于CXC趨化因子，它的主要作用是介導炎癥反應?，F(xiàn)已在多種魚類中克隆到IL-8的基因，并對其功能進行了初步研究。草魚（Ctenopharyngodon idella）不僅是我國的主要淡水養(yǎng)殖品種，也是世界第三大養(yǎng)殖品種，但草魚抗病力差，易受各種致炎因子刺激發(fā)生炎癥乃至死亡，嚴重影響草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本論文擬克隆草魚IL-8的完整基因，并對其生物學功能進行初步鑒定。

2、>　　 方法：首先，運用Rapid application of cDNA ends技術從草魚中克隆IL-8cDNA全長序列，并通過原核表達質(zhì)粒pET32a+表達IL-8融合蛋白。其次，運用Real-time PCR技術檢測健康草魚血液及12個組織的IL-8轉(zhuǎn)錄水平：同時經(jīng)腹腔注射嗜水氣單胞菌后4h，1d,3d，7d檢測腦、心臟、腸道、中腎、脾臟、頭腎、鰓、胸腺、表皮、尾鰭和肝臟等11個組織中的IL-8 mRNA相對變化量。最后，利，

3、用掃描電鏡技術和石蠟切片技術觀察4h，1d,3d，7d時草魚腸道結(jié)構的變化。
　　 結(jié)果：草魚IL-8的cDNA全長序列為609bp，其中包含5’非編碼區(qū)96bp,3’非編碼區(qū)216bp和開放閱讀框297bp:其開放閱讀框共編碼98個氨基酸，與人的IL-8相似性為45％，預測的三級結(jié)構與人的IL-8空間結(jié)構極為相似。草魚IL-8全長DNA包括四個外顯子，結(jié)構組成與其它物種的IL-8內(nèi)含子外顯子排列相似；利用表達載體成功誘導表達I

4、L-8融合蛋白，與預期大小一致。健康草魚12個組織及血液的IL-8轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果顯示，IL-8在各個組織中都有轉(zhuǎn)錄，其中肝臟中最高，鰭和表皮僅次于肝臟，腸道、中腎、脾臟、頭腎、鰓、胸腺等免疫相關組織的轉(zhuǎn)錄水平也較高。腹腔注射嗜水氣單胞菌后各組織中IL-8mRNA相對變化量檢測結(jié)果顯示，腦和鰭的IL-8無變化；心臟、腸道、中腎、脾臟、頭腎、鰓、胸腺、表皮和肝臟等9個組織中的IL-8mRNA分別在4h或1d達到最高值；其中，免疫相關組織中

5、表現(xiàn)更為明顯,3d后下降到正常水平。嗜水氣單胞菌感染刺激后草魚腸道的顯微結(jié)構變化表現(xiàn)為，腸道內(nèi)皮細胞在4h時有出現(xiàn)空泡變性，1d時粘膜下層結(jié)締組織充血，細胞腫脹，固有層淋巴細胞聚集,3d時淋巴細胞多聚集于粘膜下層結(jié)締組織，7d時腸道組織基本恢復正常。腸絨毛超微結(jié)構顯示，腸道絨毛的破損在3d時最為明顯，7d時基本恢復正常。
　　 結(jié)論：本研究成功克隆并表達了草魚完整的炎癥細胞因子IL-8，該基因在草魚體內(nèi)呈組成性表達；致病菌刺激后