水稻廣譜抗性相關(guān)基因OsMOS3的克隆及功能研究.pdf

1、水稻是我國主要的糧食作物，在其生產(chǎn)過程中由于受到稻瘟病、紋枯病以及白葉枯病的危害，水稻的質(zhì)量與產(chǎn)量受到嚴(yán)重的影響。本研究主要利用水稻基因組信息并結(jié)合生物信息學(xué)，對水稻廣譜抗病性基因OsMOS3進(jìn)行克隆并實(shí)現(xiàn)克隆基因的過量表達(dá)、RNAi以及融合表達(dá)，通過轉(zhuǎn)基因水稻對白葉枯病病原菌抗性的研究以及水楊酸含量的分析，表明OsMOS3具有廣譜抗病性。具體結(jié)果如下：
　　 1.OsMOS3及干涉片段mir的克隆
　　 結(jié)合生物信息學(xué)

2、，在水稻基因組中獲得與擬南芥中已經(jīng)克隆的AtMOS3的同源序列，將其命名為OsMOS3。以水稻日本晴的cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物分別擴(kuò)出OsMOS3A段，1475bp，OsMOS3B段，1543bp，最后通過重疊PCR(overlap)擴(kuò)出OsMOS3的cDNA全長(A+B段)，3018bp。另外，根據(jù)結(jié)構(gòu)域分析，在OsMOS3中選取一段保守且含有功能結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列作為干涉片段mir，經(jīng)特異性PCR擴(kuò)增獲得mir，250bp。分

3、別構(gòu)建出雙元表達(dá)載體CPB-OsMOS3，CPB-2F，P1302-OsMOS3-GFP。
　　 2.35S-OsMOS3-GFP的亞細(xì)胞定位
　　 通過基因槍將35S-OsMOS3-GFP融合表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞，利用熒光顯微鏡進(jìn)行亞細(xì)胞定位檢測，結(jié)果顯示OsMOS3定位在細(xì)胞核內(nèi)。
　　 3.T0代轉(zhuǎn)基因水稻的陽性檢測
　　 分別對獲得的3株OsMOS3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，1株OsMOS3-R

4、NAi轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行篩選標(biāo)記基因潮霉素(HPT)的PCR檢測，結(jié)果表明獲得的4株水稻全為陽性轉(zhuǎn)基因水稻；OsMOS3半定量凝膠結(jié)果顯示：與原始對照植株相比，OsMOS3過表達(dá)水稻中OsMOS3上調(diào)表達(dá)，OsMOS3-RANi轉(zhuǎn)基因水稻中OsMOS3表達(dá)沉默。
　　 4.T0代轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性鑒定
　　 分別檢測了OsMOS3過表達(dá)、OsMOS3-RNAi、及原始對照日本晴植株體內(nèi)游離態(tài)水楊酸(freeSA)的含量，結(jié)