TαBTF3基因在小麥中的克隆及其功能研究.pdf

1、本文采用cDNA末端快速擴增法(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)，在小麥中首次克隆出BTF3基因（命名為TaB TF3）的序列全長，并采用VIGS(Virus-inducedgene silencing，VIGS)技術(shù)對其進行基因功能鑒定。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用RACE-PCR技術(shù)從小麥中首次克隆到TaBTF3基因，其cDNA序列全長882bp，最大ORF序列為53

2、4bp，該基因編碼一個由177個氨基酸組成的蛋白，預(yù)測分子量為20KD?；蚪MDNA序列全長1742bp，包含5個外顯子、4個內(nèi)含子，內(nèi)含子和外顯子的剪切位點嚴格符合GT/AC規(guī)律。實時定量PCR檢測表明，TaBTF3在小麥根、葉、葉鞘、旗葉和幼穗中均有不同程度的表達，在旗葉中表達量最高，且受PEG、冷(4℃)、NaCl、MeJA、ABA和SA誘導(dǎo)上調(diào)表達。蛋白亞細胞定位結(jié)果表明，TaBTF3蛋白主要定位于細胞核與細胞質(zhì)。Souther

3、n雜交結(jié)果顯示，TaBTF3是多拷貝基因，以多拷貝的形式存在。
　　2.選用大麥條紋花葉病毒(BSMV)載體，在豫麥34中成功沉默報告基因TaPDS（小麥八氫番茄紅素脫氫酶基因），TaPDS-VIGS小麥植株葉片呈現(xiàn)明顯的光漂白表型。GFP蛋白熒光檢測結(jié)果表明，在BSMV-GFP植株的葉片與根系中均可以檢測到較強的GFP熒光信號，BSMV誘導(dǎo)的基因沉默是系統(tǒng)性沉默，并不僅僅局限于接種葉片。高效穩(wěn)定的小麥VIGS技術(shù)體系的成功建立，

4、為小麥TaBTF3基因功能分析驗證提供了技術(shù)平臺。
　　3.成功獲得TaBTF3-VIGS植株與BSMV-GFP對照植株，并對BSMV-VIGS植株進行鑒定、生理指標檢測。沉默TaBTF3基因?qū)е氯~綠素含量降低、MDA與H2O2含量顯著升高。通過熒光定量PCR檢測線粒體、葉綠體編碼基因的表達量變化，結(jié)果表明，與BSMV-GFP對照植株相比，沉默TaBTF3基因?qū)е戮€粒體、葉綠體編碼基因的表達量顯著下降。進一步采用石蠟切片技術(shù)觀察T

5、aBTF3-VIGS植株葉肉細胞的變化，結(jié)果顯示，與對照相比，TaBTF3-VIGS植株的葉肉細胞發(fā)育異常、體積變小、排列松散、無序、胞間隙較大。由此表明，TaBTF3可能與線粒體、葉綠體和葉肉細胞的生長發(fā)育有關(guān)。
　　4.通過熒光定量PCR檢測小麥逆境相關(guān)基因的表達量，并對TaBTF3-VIGS植株與BSMV-GFP對照植株進行脅迫耐受性檢測。結(jié)果表明，在正常生長條件下，沉默TaBTF3基因?qū)е履婢诚嚓P(guān)基因的表達被抑制。逆境脅迫