雌性牙鲆性激素合成酶相關(guān)基因SNP和DNA甲基化與繁殖內(nèi)分泌相關(guān)性研究.pdf

1、本文以人工要養(yǎng)殖雌性牙鲆（Paralichthys olivaceus）為研究對象，首次分析了cyp-17Ⅱ基因甲基化位點的突變對其基因表達和繁殖內(nèi)分泌的影響機理；并對cyp17-Ⅱ、Cyp19、Foxl2基因啟動子和編碼區(qū)CpG富集區(qū)（CpG rich region）在性腺發(fā)育期的甲基化模式對基因表達和繁殖性狀的影響進行了研究和分析。
　　1、cyp-17Ⅱ基因甲基化位點的突變對其基因表達和繁殖內(nèi)分泌的影響機理
　　細胞色

2、素P450c17-Ⅱ（cyp17-Ⅱ）是影響魚類生長，性腺分化和發(fā)育等繁殖性狀的重要因子。牙鲆cyp17-Ⅱ基因編碼區(qū)有三個CpG富集區(qū)。本文的目的是研究cyp17-Ⅱ外顯子的突變是否發(fā)生在CpG位點上，以及這些CpG位點的突變和甲基化水平是否參與調(diào)控牙鲆cyp17-Ⅱ基因表達和繁殖內(nèi)分泌。結(jié)果顯示：檢測到三個單核苷酸多態(tài)性，分別是：SNP1：[(c.G594A（p.Gly188Arg）]在外顯子4上，稱為L1位點（L1 locus）；

3、SNP2（c.A939G）和SNP3（c.C975T），位于cyp17-Ⅱ基因外顯子6的CpG富集區(qū)，稱為L2位點（L2 locus）。此外，在939bp位置A→C的轉(zhuǎn)變使cyp17-Ⅱ編碼區(qū)增加了一個新的甲基化位點。通過多重比較分析，兩個位點（L1 locus和L2 locus）都與卵巢中睪酮（T）水平（P<0.05）和cyp17-Ⅱ表達（P<0.01）顯著相關(guān)。有趣的是，GG型個體在L2位點包含8個CpG甲基化位點與包含7個甲基化位

4、點的AA型的個體相比，具有較低的睪酮水平和cyp17-Ⅱ mRNA表達含量。而且，GG型個體在938bp位置高度甲基化（≥77.8％）。這些暗示cyp17-Ⅱ編碼區(qū)突變和甲基化水平可能影響雌性牙鲆基因表達和繁殖內(nèi)分泌水平，并且，L2位點可以作為牙鲆育種的一個候選基因或遺傳標記。
　　2、牙鲆卵巢發(fā)育期內(nèi)cyp17-Ⅱ的甲基化水平與基因表達水平及繁殖性狀相關(guān)性分析
　　在魚類中細胞色素P450c17-Ⅱ（cyp17-Ⅱ,17α

5、-羥化酶）參與卵泡成熟過程中類固醇激素的產(chǎn)生。繁殖周期中cyp17-Ⅱ基因的相對表達模式將有助于闡釋其在性腺發(fā)育中的功能。此外，表觀遺傳修飾特別是DNA甲基化對基因表達調(diào)控起重要作用。本實驗以成年雌性牙鲆為研究對象，采用熒光實時定量測定牙鲆性腺cyp17-Ⅱ基因的相對表達量，并檢測性腺指數(shù)（GSI）、雌二醇、睪酮等繁殖生理指標。運用亞硫酸測序法測定位于編碼區(qū)外顯子4和6上的CpG二核苷酸甲基化水平。在性腺發(fā)育早期，cyp17-Ⅱ基因具有

6、較低的表達水平，但最后升高。同時，睪酮和雌二醇的變化趨勢與cyp17-Ⅱ基因表達趨勢相一致。相反，性腺中cyp17-Ⅱ基因在每個CpG富集區(qū)整體甲基化水平從Ⅱ期到Ⅳ下降，然后升高，其變化趨勢與性腺中基因表達、睪酮和雌二醇以及GSI相反?；诒狙芯?，提出cyp17-Ⅱ可能調(diào)節(jié)雄激素和雌激素水平，從而促進卵母細胞生長與成熟，并且cyp17-Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能受編碼區(qū)CpG富集區(qū)甲基化水平的影響。這些結(jié)果將有利于研究魚類繁殖內(nèi)分泌的分子調(diào)控

7、機制。
　　3、牙鲆卵巢發(fā)育期內(nèi)cyp19、Foxl2基因的甲基化水平與基因表達水平及繁殖性狀相關(guān)性分析
　　本實驗研究了性腺中對雌激素合成具有重要作用，并存在上下游調(diào)控關(guān)系的Foxl2基因和Cyp19a基因，從表觀遺傳學角度闡釋Foxl2對Cyp19a基因的調(diào)控機制，以及這兩種基因在卵巢發(fā)育周期中的表達機理。通過相對熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)Foxl2基因和Cyp19a基因均隨卵巢發(fā)育期呈相同變化規(guī)律，即在Ⅱ期表達量相對較低，隨后在

8、Ⅲ期和Ⅳ期不斷上升并達到最高之后在Ⅴ出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。運用亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測Cyp19a基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)外顯子1區(qū)域的CpG富集區(qū)甲基化模式，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)的9個CpG位點的甲基化水平隨性腺發(fā)育呈現(xiàn)出與基因表達相反的變化趨勢；其中-223bp位置的CpG二核苷酸位于cAMP反應元件結(jié)合蛋白識別序列，-141bp位置的CpG二核苷酸位于Ad4結(jié)合蛋白（Ad4BP）識別序列；而外顯子1區(qū)域的CpG富集區(qū)的11個甲基化位

9、點的甲基化水平變化趨勢也與基因表達趨勢成負相關(guān)性，其中有7個可能位于假定的轉(zhuǎn)錄因子的相應結(jié)合序列上。根據(jù)DNA高甲基化水平會抑制基因表達的原理，我們推測位于Cyp19a基因啟動子區(qū)的順式作用原件識別序列上的CpG位點的甲基化模式可能會改變轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合的效率，從而改變基因轉(zhuǎn)錄效率。Foxl2可以通過直接結(jié)合到Cyp19a基因啟動子區(qū)的結(jié)合序列上或者通過先與Ad4結(jié)合蛋白相結(jié)合然后再結(jié)合到啟動子區(qū)的Ad4結(jié)合蛋白的識別序列上調(diào)控Cyp1

10、9a基因表達。本實驗還檢測了Foxl2基因編碼區(qū)3個CpG富集區(qū)（依次命名為F1、F2和F3）的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)其總甲基化概率與其基因表達成負相關(guān)性，這表明Foxl2基因本身的轉(zhuǎn)錄效率受其CpG富集區(qū)甲基化模式調(diào)控。此外，F(xiàn)oxl2基因保守區(qū)FH區(qū)域（fork head domain，F(xiàn)HD）位于F1和F2上，F(xiàn)HD對于Foxl2準確結(jié)合到目標基因至關(guān)重要，因此推測FHD上的CpG位點的甲基化模式的變化可能會影響其與靶基因的結(jié)合效率。總

11、之，通過本文的研究我們可以推測出Foxl2通過其FDH結(jié)合到Cyp19a啟動子區(qū)域的結(jié)合位點調(diào)控Cyp19a基因的表達；另外，F(xiàn)oxl2和Cyp19a基因轉(zhuǎn)化效率也可能受其本身CpG富集區(qū)甲基化模式的影響。本實驗結(jié)果為闡釋Foxl2調(diào)控Cyp19a的調(diào)控機制提供強有力的理論依據(jù)，進一步揭示出Cyp19a和Foxl2基因?qū)Υ菩匝丽倚韵侔l(fā)育起重要作用。
　　綜上所述，本研究對牙鲆cyp17-Ⅱ基因編碼區(qū)SNP進行檢測，并對cyp17-