喹噁啉類對腎上腺皮質(zhì)醛固酮分泌細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)表達(dá)影響研究.pdf

1、喹噁啉類藥物是一類人工合成的、含有喹噁啉-1，4-二氧化物基本結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)合成抗菌藥物，在提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動物生長方面具有相當(dāng)好的活性。隨著該類藥物的廣泛使用，卡巴氧和喹乙醇已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有明顯的致癌、致畸、致突變、光敏和腎上腺皮質(zhì)損傷等副作用。腎上腺是該類化合物主要的毒性靶器官之一，該類中大多數(shù)藥物對腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生損害，引起球狀帶分泌的醛固酮減少，造成動物機(jī)體內(nèi)水鹽代謝紊亂。為了闡述喹噁啉類藥物對腎上腺產(chǎn)生毒性，及其下調(diào)醛固酮激素分

2、泌水平，造成水鹽代謝紊亂的機(jī)制，本課題以人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞NCI-H295R細(xì)胞系為細(xì)胞模型，應(yīng)用基因芯片，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)中經(jīng)典的雙向電泳和質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術(shù)為手段展開研究。
　　本研究首先測定了喹噁啉類藥物喹烯酮和乙酰甲喹孵育H295R細(xì)胞12、24及36h時(shí)的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，兩種藥物對H295R細(xì)胞的毒性均呈現(xiàn)出劑量依賴性和時(shí)間依賴性趨勢，并且初步確定喹烯酮的細(xì)胞毒性大于乙酰甲喹的。然后在保證細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上，調(diào)整藥物

3、濃度，采用醛固酮ELISA檢測試劑盒檢測藥物對H295R細(xì)胞分泌醛固酮激素的影響，結(jié)果顯示，喹烯酮下調(diào)醛固酮激素分泌的能力也強(qiáng)于乙酰甲喹的。當(dāng)QCT孵育細(xì)胞12h，各個(gè)藥物濃度作用下，醛固酮激素分泌水平均沒有發(fā)生顯著變化;當(dāng)15μMQCT孵育細(xì)胞24h后，醛固酮激素的分泌量顯著性下降(75.85％±1.09％)(p＜0.05)，20μMQCT孵育細(xì)胞24h后，醛固酮激素分泌量極顯著性下降(44.00％±6.98％)(p＜0.01)。所以

4、，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用喹烯酮作為受試藥物，并且確定藥物作用時(shí)間為24h，作用劑量為一個(gè)低劑量10μM和一個(gè)高劑量20μM。
　　10和20μMQCT孵育H295R細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對照，藥物與細(xì)胞作用24h后，采用Agilent公司生產(chǎn)的人表達(dá)譜芯片篩選兩個(gè)藥物劑量下H295R細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，10μM喹烯酮處理組與空白組相比有349個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因有210個(gè)（名稱和功能已知的基因有150個(gè)），下調(diào)基因有139個(gè)

5、（已知基因有98個(gè)）;20μM喹烯酮處理組與空白組相比有4583個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)的有2835個(gè)（名稱和功能已知的基因有1931個(gè)），下調(diào)的有1748個(gè)（已知基因有1095個(gè)）。將這些差異基因按生物學(xué)進(jìn)程分為6類:與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量合成代謝相關(guān)、與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)、與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)、與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)、與細(xì)胞發(fā)育過程相關(guān)及與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。分析相關(guān)基因功能，與無機(jī)離子、氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)、糖類、嘌呤和脂肪酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因的表達(dá)量發(fā)生改變，提示喹烯

6、酮干擾了細(xì)胞內(nèi)正常的生命活動。參與類固醇激素合成和代謝的基因表達(dá)量也發(fā)生了改變，特別是與膽固醇合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)量均上調(diào)，而負(fù)責(zé)將膽固醇外排出細(xì)胞的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體也發(fā)生上調(diào)表達(dá);同時(shí)，膽固醇合成原料乙酰輔酶A提供者-脂肪酸在一種高度上調(diào)表達(dá)的SREBF1的作用下合成甘油三酯的進(jìn)程加劇，三者協(xié)同作用影響醛固酮合成原料-膽固醇的濃度;控制類固醇激素合成方向的基因CYP17A1表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致醛固酮合成受阻;另外調(diào)控CYP11B2轉(zhuǎn)錄的一種

7、重要轉(zhuǎn)錄因子NR4A2的表達(dá)量下調(diào)，抑制其轉(zhuǎn)錄;同時(shí)與氧化應(yīng)激相關(guān)的一些基因表達(dá)量下調(diào)，提示QCT可能通過抑制Nrf2/Keap1/ARE通路的下游基因NQO1、HMOX1、G6PD和SRXN1等的表達(dá)，加劇藥物造成的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，進(jìn)而造成ROS的大量蓄積，引起腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞毒性。挑選6個(gè)基因，采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，挑選的6個(gè)基因的變化趨勢與芯片結(jié)果基本保持一致;并選擇Keap1運(yùn)用Westernblot技術(shù)研究其蛋白

8、表達(dá)情況，結(jié)果該蛋白表達(dá)量的變化趨勢與芯片結(jié)果基本一致。所以基因芯片結(jié)果的可靠性得到了保證。
　　運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)和飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與空白組細(xì)胞相比，喹烯酮處理H295R細(xì)胞24h后，共鑒定出41種差異蛋白質(zhì)，分為8類:包括物質(zhì)合成及能量代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)加工相關(guān)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞骨架類蛋白、分子伴侶、應(yīng)激蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其他。其中多個(gè)物質(zhì)和能量代謝中比較重要的酶類，如與ATP合成相關(guān)的二烯酰基輔

9、酶A異構(gòu)酶、醛脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯酶及核苷二磷酸激酶A等表達(dá)水平發(fā)生改變。結(jié)合基因芯片結(jié)果，推斷喹烯酮干擾了H295R細(xì)胞內(nèi)正常的物質(zhì)和能量合成代謝過程;喹烯酮通過下調(diào)葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的表達(dá)，干擾醛固酮合成過程中羥化酶所需NADPH的供應(yīng)，影響醛固酮的生物合成通路。此外，其他蛋白質(zhì)，如消除代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物的過氧化物酶-2的表達(dá)量的下調(diào)，與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白如脂肪酸結(jié)合蛋白及與凋亡相關(guān)的蛋白如程序性

10、細(xì)胞死亡蛋白5的下調(diào)，在喹烯酮對H295R細(xì)胞發(fā)揮毒性作用時(shí)發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。挑選TCP1和NME1采用Westernblot技術(shù)驗(yàn)證雙向電泳和質(zhì)譜分析結(jié)果，兩者結(jié)果保持一致。
　　綜上所述，本研究首次運(yùn)用基因組和蛋白質(zhì)組技術(shù)，探討了喹噁啉類藥物對動物機(jī)體的腎上腺產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制及引發(fā)醛固酮激素合成和分泌紊亂的機(jī)理，我們發(fā)現(xiàn)ABCG1、SREBF1等與調(diào)控膽固醇濃度的相關(guān)基因及CYP17A1、NR4A2、G6PD等與醛固酮合成相關(guān)基