喹噁啉類對敏感大腸桿菌基因和蛋白質(zhì)表達的影響研究.pdf

1、喹噁啉類化合物(Quinoxalines)是一類人工合成的抗菌藥，均屬喹噁啉-1，4-二氧化物的衍生物，表現(xiàn)出很好的抗菌促生長效應(yīng)。本實驗室已經(jīng)進行了喹噁啉類的體外抑菌試驗以及喹噁啉類對畜禽常見致病菌引發(fā)的疾病的預(yù)防效果研究，說明該類藥物的確具有有較強的抑菌效果，但是喹噁啉類化合物的抗菌機制至今未得到很好的揭示。目前只知道喹噁啉類化合物喹多辛的抗菌作用方式是抑制細菌的DNA合成，但是其真正的DNA損傷機制和抗菌靶點需要進行更清楚深入的探

2、討?，F(xiàn)今，基因組和蛋白組學(xué)技術(shù)已成為研究藥物作用機理和靶點的新手段。本研究選取了喹噁啉類新藥喹賽多和對喹賽多敏感的大腸桿菌作為研究對象，喹乙醇作為喹噁啉同類藥物，通過基因芯片篩選出喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌前后的差異表達基因，分析與藥物作用相關(guān)的基因以及藥物對細菌生長繁殖、新陳代謝和毒力等多方面的影響，提出喹噁啉類藥物抗菌機理假設(shè)，并確定藥物可能的抗菌靶點。采用優(yōu)化的大腸桿菌雙向電泳-質(zhì)譜鑒定技術(shù)考察喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌前后的差異

3、蛋白，對差異基因結(jié)果提供補充和完善。對喹賽多和喹乙醇抗菌機理的研究將加快喹噁啉類藥物的研發(fā)速度，為該藥申報提供更全面的合乎國際和國內(nèi)標準的資料，為日后的臨床用藥提供參考依據(jù)、為動物和人類用藥安全提供保障。
　　 1.細菌的選擇和藥物作用濃度和時間的確定
　　 為了選擇合適的敏感菌，分別在厭氧和有氧條件下，采用微量肉湯稀釋法測定喹賽多和喹乙醇對動物源致病性大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明

4、在厭氧條件下喹賽多和喹乙醇對大腸桿菌C84010的MIC為1μg/mL和4μg/mL，有氧條件下MIC都為16μg/mL，較其他幾株菌C84010對喹賽多最為敏感，因此選擇這株病原菌作為研究對象。其中在厭氧條件下，喹賽多和喹乙醇的抗菌活性明顯提高，與已有文獻關(guān)于喹噁啉類化合物厭氧條件下抗菌活性更高的報道一致，說明在厭氧條件下探討喹噁啉類藥物的抗菌機制更有意義。
　　 為了找出與藥物作用直接相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)以及藥物濃度與基因變化

5、之間的劑量關(guān)系，使用活菌計數(shù)法測定不同濃度藥物處理后細菌的生長曲線，結(jié)果表明0.5MIC的喹賽多和1MIC的喹乙醇作用后，細菌的生長減慢，但是曲線仍然呈上升趨勢；MBC的喹賽多和喹乙醇作用細菌30min后，90%的細菌死亡，因此確定藥物濃度分別為0.5MIC、MBC的喹賽多和1MIC、MBC的喹乙醇，藥物孵育時間為30min。
　　 2.喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌后的差異表達基因
　　 為了深入研究喹噁啉類藥物抗菌的分子

6、作用機制，按照上述結(jié)果，選擇用0.5MIC、MBC喹賽多和1MIC、MBC喹乙醇處理30min的大腸桿菌作為四個不同的藥物處理組，1%DMSO處理相同時間后的大腸桿菌作為對照組，用芯片方法篩選藥物作用后的差異表達基因，并對差異基因進行功能分類和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析。
　　 從0.5MIC的喹賽多作用后的大腸桿菌中篩選出25個差異基因，全部呈顯著的上調(diào)表達；從MBC的喹賽多作用后的大腸桿菌中篩選出55個差異基因，其中46個顯著上調(diào)，9個

7、顯著下調(diào)。從MIC的喹乙醇作用后的大腸桿菌中篩選出166個差異基因，68個基因呈顯著的上調(diào)，98個基因顯著下調(diào)表達：從MBC的喹乙醇作用后的大腸桿菌中篩選出102個差異基因，其中81顯著上調(diào)，21個顯著下調(diào)。
　　 這些差異基因可以分為7大類，包括SOS基因、細胞膜相關(guān)基因、細胞毒性相關(guān)基因、物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因、細胞色素氧化酶基因、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因和假定基因。其中四個藥物處理組共同引起DNA損傷修復(fù)SOS基因的上調(diào)表達，SO

8、S基因占0.5MIC喹賽多作用后差異基因的80%，且這些基因的變化倍數(shù)與藥物濃度之間存在明顯的劑量關(guān)系，表明喹賽多和喹乙醇對細菌的DNA有明顯的損傷作用。推測喹賽多和喹乙醇在厭氧條件下經(jīng)過還原代謝激活反應(yīng)產(chǎn)生的芳香族自由基中間體會作用于DNA核糖上的C1位，造成大腸桿菌內(nèi)DNA的斷裂損傷。MBC的喹賽多和喹乙醇對細菌DNA損傷后，大量細菌死亡，部分存活下來的細菌需啟動抗應(yīng)激相關(guān)的調(diào)控基因(yjbJ，marA)，調(diào)控多種基因的表達以適應(yīng)環(huán)

9、境的急劇改變，如減慢蛋白質(zhì)合成速度(yafO)，關(guān)閉鞭毛的運動性(fliM)，減弱細胞膜運輸物質(zhì)的功能(rbsC、proV和treB)等，同時引起外排泵基因(ydhC)的上調(diào)表達，將喹賽多和喹乙醇排出細菌外。
　　 3.喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌后的差異表達蛋白
　　 為了從蛋白質(zhì)翻譯水平補充和完善差異基因的結(jié)果，采用優(yōu)化的大腸桿菌雙向電泳方法，篩選喹賽多和喹乙醇作用細菌后的差異表達蛋白。差異蛋白的功能主要是與DNA修復(fù)

10、、抗氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)合成、細菌形態(tài)和細菌毒性等相關(guān)。LexA蛋白的下調(diào)表達與基因芯片結(jié)果中l(wèi)exA的上調(diào)表達相反，是基于LexA的自降解活性，LexA自剪切后激活SOS基因表達；在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)了另外的抗氧化應(yīng)激蛋白Ssb和YgfZ上調(diào)表達，保護細菌DNA免受氧化損傷；蛋白質(zhì)合成延伸因子下調(diào)表達，與芯片結(jié)果中蛋白質(zhì)翻譯抑制基因的上調(diào)表達結(jié)果一致，推測細菌在藥物作用下，關(guān)閉蛋白質(zhì)合成直至恢復(fù)正常生長；另外決定大腸桿菌形態(tài)的MreB蛋白下調(diào)

11、，提示藥物作用后細菌形態(tài)的改變，與基因芯片結(jié)果中sulA上調(diào)表達導(dǎo)致細菌成絲狀的現(xiàn)象一致。
　　 綜上所述，本研究采用基因芯片和雙向電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量DNA損傷修復(fù)基因和蛋白的差異表達，表明在厭氧條件下這兩種喹嗯啉類藥物通過還原激活反應(yīng)產(chǎn)生的中間體自由基對細菌DNA造成了嚴重損傷，從而發(fā)揮抗菌作用。同時藥物對細菌DNA產(chǎn)生的損傷作用，直接或間接地影響了細菌各個方面的正常代謝活動。因此，本課題的研究成果為進一步研究喹噁啉類藥物的抗菌