布拉酵母預防腸炎沙門氏菌感染的機制研究及其堿性磷酸酶的重組表達與性質(zhì)分析.pdf

1、伍代朝布拉酵母預防腸炎沙門氏菌感染的機制研究及其堿性磷酸酶的重組表達與性質(zhì)分析l摘要布拉酵母在臨床上主要用于防治大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、難辨梭菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母和原蟲等病原體感染引起的疾病。同時，布拉酵母分泌的堿性磷酸酶(AP)能夠?qū)Ω锾m氏陰性菌LPS去磷酸化，而阻斷由LPS介導的下游信號通路。本研究一方面研究布拉酵母預防腸炎沙門氏菌感染的機理。另一方面克隆布拉酵母堿性磷酸酶(SBAP)基因，并實現(xiàn)其在畢赤酵母中重組

2、分泌表達，初步研究rAP對LPS去磷酸化作用，為該蛋白藥物治療LPS所致的疾病提供基礎。1)為了探討布拉酵母預防腸炎沙門氏菌感染的機理，構(gòu)建經(jīng)布拉酵母預處理的小鼠腸炎沙門氏菌感染模型。在感染后監(jiān)測小鼠體重變化及腸炎沙門氏菌在肝臟和盲腸中的數(shù)量，掃描電鏡觀察布拉酵母對腸道微生物的吸附作用，HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況。結(jié)果表明，感染后第1l天，布拉酵母緩解由腸炎沙門氏菌感染所致的小鼠體重下降的現(xiàn)象(259g：223g)(p005)。在盲

3、腸定植的腸炎沙門氏菌數(shù)由107cfu／g降低為105cfu／g，其在肝臟的數(shù)量由104cfu／g降低為4102cfu／g。肝組織HE染色結(jié)果表明，布拉酵母能夠緩解由腸炎沙門氏菌感染所引起的中性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞浸潤肝細胞所造成的肝損傷。2)本試驗通過酵母屬AP蛋白序列相似性比對，據(jù)得到保守位點設計兼并引物，克隆SBAP基因。構(gòu)建畢赤酵母甲醇誘導型表達載體pPICSAP，電轉(zhuǎn)畢赤酵母x33，將篩選后表達重組AP(rAP)的重組酵母在

4、200ml搖瓶水平放大誘導表達，其發(fā)酵液上清用HisTrapHP柱純化。結(jié)果表明，成功克隆SBAP基因，其大小為1701bp，無內(nèi)含子，包含一個終止密碼子，GenBank編號為KF471017。pPICSAP重組表達菌株在200ml搖瓶水平誘導表達120h時，rAP的濃度達到最大值為4366mg／l。純化過程中確定洗脫緩沖液中咪唑最適濃度為250mM，洗脫峰經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳和Bandscale軟件分析，呈單一條帶，其純度達到90

5、％以上。3)本試驗初步測定在二乙醇胺緩沖液中，M92、EDTA、溫度和pH對rAP酶活性的影響，及在最佳酶活條件下測定rAP的比活。同時，在pH210的TrisHCl緩沖液中，體外檢測rAP對LPS去磷酸化功效，及腹腔注射經(jīng)rAP去磷酸化后的LPS對小鼠血清中TNFa表達水平的影響。結(jié)果表明，在二乙醇胺緩沖液中，rAP的最佳反應條件是pH96，2mMM92，溫度為60℃，且EDTA為rAP的強抑制劑，1mM的EDTA將rAP的酶活抑制到

6、其活性的1837％。rAP比活為9912U／mg，是先前研究中重組表達的小牛腸AP比伍代朝布拉酵母預防腸炎沙門氏菌感染的機制研究及其堿性磷酸酶的重組表達與性質(zhì)分析3AbstractSaccharomycesboulardiiisusedinclinicalapplicationforprophylaxisandthetreatmentofavarietyofdiseasescausedbybacterialinfection，sucha

7、sEscheriacoli，Salmonellatyphimurium，Vibriocholera，Clostridiumdifficile，Helicobacterpylori，CandidaalbicansandprotozoaBesides，theAPof&boulardiiwithdetoxificationofLPSviadephosphorylatedthelipidAofLPSInthisresearchwepartlyr

8、evealedthepreventionmechanismof&boulardiiagainstSalmonellaenteritidisinfectionandheterologouslyexpressedthealkalinephosphataseof&boulardiiinPpastorisThedetailsoftheresearchareasfollows：1Torevealthemechanismofsboulardiiag

9、ainstsenteritidisinfection，weusedamousemodelofsenteritidisinfectionwhichpre—treatmentwithsboulardiiAfterSenteritidischallenged，weevaluatedtheamountsofSenteritidisincecumandintheliverBesides，cecumwerecollectedtoanalysethe

10、adsorptionbetween&boulardiiandintestinalmicrofloraHepatictissuesdamagewerealsoanalysedusingHEstainingTheresultsshowedthat&boulardiiremittedweightlossofmicecausedby&enteritidisinfection(259gto223g)p005)atthe1lthday，thecol

11、onisationofSenteritidisincecumcontentswasdecreasedfrom107cfWgto105cfu／gandthetranslocationbacteriainliverwasdecreasedfrom104cfu／gto4xl02cfu／gatthelOthday，andremittedthedamageofthelivercausedbytheinfiltrationofneutrophile

12、granulocyte，lymphocyteandplasmocyte，viadecreasingtheamountsofSenteritidisintheliver2Inthisresearch，inordertogettherecombinationalkalinephosphatase(rAP)WecloningoftheSBAPgene，andconstructionoftherecombinantplasmidspPICSAP

13、whichwerelinearizedbydigestionwithPmeIandtransformedintoPpastorisX33byelectroporationAfterscreeningfortransformants，thepositivetransformantswereselectedforenlargeexpressionin200mlshakefasksThefermentationsupernatantWaSus

14、edforpurificationofrAPbyHisTrapHPcolumnTheresultsshowedthatanovelSBAPgene(withoutintrons)wasclonedfromSboulardiiATCCMYA一796withaGenBankaccessionnumberKF471017Afterscreeningfortheenzymeactivityoftmnsformants，therAPwasexpr

15、essedinPpastor括X33withayieldof4366mg／1attheendof120hofinductioninashakerflaSkwith200mlfermentationbrothAfterpurificationbyaffinity—columnchromatographyoptimumconcentrationofimidazoleinelutionbufferwas250mM，thepeakfractio