大腸桿菌Nissle 1917無質(zhì)?？寺【瓯廾砻嬲故竟δ芴轿?pdf

1、大腸桿菌Nissle1917(Escherichia coli Nissle1917; EcN)是德國醫(yī)生Alfred Nissle于1917年從一名抗腹瀉士兵糞便中首次分離出的一株益生菌，由于腸道內(nèi)存在該株“強大效能且具有拮抗活性”的大腸桿菌，該士兵免受腸道傳染病流行區(qū)疾病的侵擾。隨后，在德國和其他一些歐洲國家，EcN作為人用藥Mutaflor(@)的活性成分，在治療各種腸道疾病中扮演著重要角色。近年來，EcN表達外源基因作為疾病診治

2、載體的研究越來越多，其內(nèi)含的pMUT2、Ⅰ型分泌系統(tǒng)以及Ⅴ型分泌系統(tǒng)等皆用于將外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示屬于細菌表面展示技術(shù)之一，其基于鞭毛蛋白的高變區(qū)可容納外源多肽且組裝成鞭毛絲進而實現(xiàn)外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技術(shù)較多在報道沙門氏菌中，而未曾在EcN菌株中探索研究。鑒于EcN是強大效能益生菌，本研究首先構(gòu)建了EcN無質(zhì)粒克隆菌株EcNc（EcN cured of its two cryptic plasmids p

3、MUT1 and pMUT2; EcNc），以其鞭毛蛋白高變區(qū)為切入點來探討EcNc鞭毛表面展示。
　　EcN中含有pMUT1、pMUT2兩個隱秘大質(zhì)粒，且2個質(zhì)粒在傳代中很穩(wěn)定，不易丟失;pMUT1帶有ColE1類型復(fù)制系統(tǒng)，pMUT2含有類ColE2復(fù)制系統(tǒng)，然而對這2個隱秘大質(zhì)粒的生物學(xué)意義了解較少。有研究報道大腸桿菌的致病性受到質(zhì)粒的調(diào)控，且部分大腸桿菌菌株的抗性基因也可能與其隱秘質(zhì)粒有關(guān)。為減少上述隱秘質(zhì)粒對外源性重組質(zhì)

4、粒轉(zhuǎn)化和基因組DNA操作帶來的不便，同時考慮EcN作為載體菌時其隱秘質(zhì)粒對人和宿主動物可能產(chǎn)生的副作用，本試驗使用限制性內(nèi)切酶SphⅠ將攜帶sacB的自殺性質(zhì)粒載體pRE112分別與隱秘質(zhì)粒pMUT1、pMUT2連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112，進一步應(yīng)用競爭性抑制分別去除EcN自身攜帶的隱秘質(zhì)粒，基于自殺性質(zhì)粒sacB基因的特性，在含10％蔗糖的培養(yǎng)基平板上實施自殺質(zhì)粒自身消除，最后獲得EcN無

5、質(zhì)?？寺【昙碋cNΔpMUT1ΔpMUT2，命名為EcNc（EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)。對無質(zhì)粒菌株EcNc生長狀況、生化試驗、電鏡觀察以及體外細胞黏附檢測，試驗結(jié)果表明去除兩個隱秘大質(zhì)粒后的EcNc，其生長、生化特性、血清學(xué)、形態(tài)學(xué)特征、體外細胞黏附與原型EcN一致，利用獲得的EcNc菌株，將更加方便質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和遺傳相關(guān)生物學(xué)操作。
　　基于編碼E

6、cN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列，利用九噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對EcNc菌株的fliC基因進行敲除。首先純化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表達盒的PCR擴增產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化至已攜帶pKD46質(zhì)粒的EcNc菌株中，在Red同源重組酶Gam、Exo、Beta的作用下，PCR回收片段通過兩翼同源序列與染色體對應(yīng)靶基因序列同源重組，在氯霉素抗性平板上篩選到一次同源重組菌株EcNcΔfliC∷cat。再將質(zhì)粒pCP20電

7、轉(zhuǎn)化EcNcΔfliC∷cat菌株，通過其在42℃表達的Flp重組酶消除PCR片段中FRT位點之間的氯霉素抗性基因。經(jīng)過PCR鑒定和DNA測序證明二次重組菌，即fliC缺失菌株EcNcΔfliC構(gòu)建成功。將pBR322-fliC電轉(zhuǎn)化EcNcΔfliC構(gòu)建了回補菌株EcNcΔfliC/pBR322-fliC。同時，以構(gòu)建好的pUC18-fliC重組質(zhì)粒為模板，通過反向PCR分別構(gòu)建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片

8、段fliC1、fliC2，雙酶切后連接到自殺載體pRE112中，構(gòu)建重組自殺載體pRE112-fliC1、pRE112-fliC2，將其分別導(dǎo)入EcNc菌株中，通過一次重組、二次重組及DNA測序篩選到EcNc鞭毛蛋白基因部分高變區(qū)缺失的菌株EcNc fliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNcΔfliC、 EcNcΔfliC/pBR322-fliC、EcNcfliC1、EcNc fliC2的成功構(gòu)建，旨在進一步探索鞭毛蛋白高變

9、區(qū)序列改變對EcNc性狀的影響。
　　測試EcNc、EcNcΔfliC、EcNcΔfliC/pBR322 fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生長性能、運動性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及體外細胞黏附、體內(nèi)腸道定植能力。結(jié)果顯示，各株細菌生化特性一致，生長性能沒有差異變化;EcNcΔfliC在半固體培養(yǎng)基上無運動性能，Western blot檢測不到鞭毛蛋白的表達，且電鏡下觀察不到鞭毛形態(tài)，其對IPEC-J2的黏附能

10、力相對于EcNc則下降64％(p=0.002)、相對于EcNc fliC1下降52％(p=0.018)、相對于EcNc fliC2下降50％(p=0.01)。EcNcΔfliC回補菌株EcNcΔfliC/pBR322-fliC與EcNc的特性相一致，對IPEC-J2的黏附能力恢復(fù)到EcNc的黏附水平;用Western blot能檢測到EcNc fliC1、EcNcfliC2鞭毛蛋白的表達，電鏡下亦能觀察到鞭毛絲，但它們在半固體培養(yǎng)基上幾

11、乎不能運動，EcNc fliC1、EcNcfliC2對IPEC-J2的黏附能力相對于EcNc則分別下降26％(p=0.124)，29％(p=0.586)，差異不顯著;但EcNc fliC1對IPEC-J2的黏附能力比EcNcΔfliC高52％(p=0.018)，EcNc fliC2對IPEC-J2的黏附能力比EcNcΔfliC高50％(p=0.01)。在體內(nèi)腸道定植試驗中，接種后第1d、第3d、第7d取樣檢測，各組細菌在同一腸段（回腸、

12、盲腸或結(jié)腸）的定植能力無顯著差異;但各組細菌在盲腸的定植數(shù)量高于各自在回腸和結(jié)腸的定植，尤其是接種后第1 d，EcNc/pBR322、EcNcΔfliC/pBR322-fliC、 EcNc fliC1/pBR322、EcNc fliC2/pBR322在盲腸的定植顯著高于其各自在回腸的定植數(shù)量。EcNc還具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子，他們也共同介導(dǎo)和促進細菌在動物體內(nèi)的定植，使得EcNcΔfliC/pBR322也能在小鼠腸道有效

13、定植。EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)分別缺失287-296位或者277-286位10個氨基酸后亦能表達鞭毛蛋白并形成鞭毛絲，且不影響重組菌在小鼠體內(nèi)的定植能力，說明EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)能容許部分氨基酸的缺失。
　　隨后本研究嘗試以鞭毛基因高變區(qū)表面展示外源基因。以重組質(zhì)粒pUC18-fliC為模板，設(shè)計兩對含六聚組氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物，反向PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ、ExnaseTMⅡ重組環(huán)化，分別獲得含有嵌合鞭毛基因片段(

14、fliC01、fliC02)的重組質(zhì)粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02，fliC01、fliC02這兩個片段為將六聚組氨酸肽(6His)基因分別插入EcNc fliC高變區(qū)774-775位和792-811位堿基之間的序列。將fliC01、fliC02片段分別插入自殺性載體pRE112，獲得重組質(zhì)粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02，再將其分別轉(zhuǎn)化EcNc。通過一次重組和二次重組將嵌合鞭毛基因整合入E

15、cNc基因組中，最終獲得無抗性篩選盒的重組菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。對重組菌株生長狀況、鞭毛形成以及體外細胞黏附試驗和小鼠體內(nèi)定植試驗分析，結(jié)果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生長未受影響，表達的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag單抗識別并且能組裝形成鞭毛絲;EcNcfliC01、EcNc fliC02對IPEC-J2細胞的黏附能力及小鼠腸道定植能力與EcNc相比無顯著性差異。EcNc

16、鞭毛蛋白插入6His后能將其展呈于菌體表面。
　　在利用EcNc鞭毛成功展示6His后，本研究以重組質(zhì)粒pUC18-fliC為模板，設(shè)計兩對分別含有BVDV(Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T細胞表位基因的反向PCR引物，反向PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ、ExnaseTMⅡ重組環(huán)化，分別獲得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重組質(zhì)粒pUC18-fliCB、pUC18-fliC

17、T，fliCB、fliCT片段為將B細胞表位、T細胞表位基因分別插入fliC基因792-811位堿基之間構(gòu)建的嵌合鞭毛基因片段。將fliCB fliCT片段分別插入自殺性載體pRE112，獲得重組質(zhì)粒pRE112-fliCB、pRE112-fliCT，再將其分別轉(zhuǎn)化EcNc。通過一次重組和二次重組將嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因組中，篩選獲得無抗性篩選盒的重組菌株EcNcfliCB、EcNcfliCT。兩株重組菌株生長、鞭毛形成以及體外

18、細胞黏附試驗與EcNc無顯著差異;在半固體平板上，EcNcfliCB無運動性，而EcNcfliCT具有運動性。將EcNc、EcNc fliCB、EcNcfliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠，二免后一周收集血液和腸道，檢測小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗B、T細胞表位的特異性抗體IgA、IgG，結(jié)果表明，免疫重組菌株EcNc fliCB能夠刺激機體產(chǎn)生抗B細胞表位的IgG抗體（0.552±0.027），免疫EcNc fliCT同樣能夠刺激機體產(chǎn)生抗T

19、細胞表位IgG抗體（0.515±0.049），空白對照組（免疫EcN）未檢測出針對相應(yīng)包被蛋白的IgG抗體。免疫EcNcfliCB小鼠腸道能檢測出針對B細胞表位的IgA抗體（0.367±0.030），與空白對照組差異顯著（0.040±0.017; p=0.040）;免疫EcNc fliCT小鼠腸道能檢測出針對T細胞表位的IgA抗體（0.371±0.034），與空白對照組差異顯著（0.024±0.010;p=0.025）。EcNcfliC