基于轉(zhuǎn)錄組測序的光皮樺應(yīng)拉木形成分子機制研究.pdf

1、光皮樺（Betula luminifera）既是優(yōu)先推廣的優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種，也是林木遺傳研究的理想材料。材性改良是現(xiàn)階段光皮樺育種的重要內(nèi)容之一，然而同其他樹種一樣，如何縮短其選擇周期，加快遺傳改良進程，是急需解決的難題。該問題的解決有賴于對其木材品質(zhì)性狀遺傳基礎(chǔ)的了解和掌握程度。近年來，一種基于第二代測序平臺的RNA-Seq技術(shù)已被成功應(yīng)用于非模式木本植物重要性狀關(guān)鍵候選基因的挖掘和分子機制的解析。本論文在原有工作基礎(chǔ)上，進一步研究明

2、確光皮樺應(yīng)拉木的特殊材質(zhì)表型及其與內(nèi)源激素分布的關(guān)系;同時應(yīng)用RNA-Seq深度分析轉(zhuǎn)錄組特征和應(yīng)拉木形成早期階段的基因表達模式，挖掘與木材材性形成聯(lián)系的關(guān)鍵候選基因。其主要結(jié)果如下:
　　 1.光皮樺經(jīng)40天的拉彎處理，應(yīng)拉區(qū)木質(zhì)部的細胞壁明顯增厚，纖維平均雙壁厚是對應(yīng)木的1.5倍，形成了明顯的膠質(zhì)纖維層。應(yīng)拉木的平均纖維長度、纖維素含量均明顯大于對應(yīng)木，而木質(zhì)素含量則表現(xiàn)相反。3個處理時間應(yīng)拉木中蔗糖、果糖含量皆高于對應(yīng)木和

3、直立木的數(shù)值，說明應(yīng)拉木形成早期階段碳流已朝纖維素合成方向轉(zhuǎn)變。同階段應(yīng)拉區(qū)IAA含量皆小于對應(yīng)區(qū)，但僅處理7天的木質(zhì)部樣品兩區(qū)塊間差異達到顯著水平。GA和BR也表現(xiàn)出與IAA類似的變化規(guī)律。而ZR含量在兩區(qū)塊木質(zhì)部間皆無明顯差異，但表現(xiàn)出隨處理時間延長而增加的趨勢。可見，IAA等激素的重新分布可能不是導(dǎo)致光皮樺應(yīng)拉木形成的起始因素。
　　 2.利用Illumina的Hiseq2000平臺對光皮樺8種組織的轉(zhuǎn)錄組進行了深度測序，

4、總共獲得2.1×107個Reads，產(chǎn)生1.9 Gbp的序列數(shù)據(jù)。經(jīng)拼接得到54，777個Unigenes，平均長度443 bp，總堿基數(shù)達24.20Mb。通過與NR和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫的比對，65.8％(35，920)的Unigenes得到了注釋信息，涉及24，482個不重復(fù)的蛋白序列號。同時，7，954和9，997個Unigenes分別獲得了GO和COG分類信息，且15，427個Unigenes被匹配到125個代謝通路。通過

5、基因名搜索和序列比對，19個參與纖維素、木質(zhì)素合成途徑酶的編碼基因被鑒定，而且其中多數(shù)基因在光皮樺基因組中表現(xiàn)為多成員家族。為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序獲得的結(jié)果，15個參與纖維素、木質(zhì)素合成基因的全長cDNA被克隆。經(jīng)序列比對，28個Unigenes覆蓋了這些目標(biāo)基因的不同區(qū)域，且序列一致性達96.0％以上。進一步的定量PCR分析不僅驗證了15個目標(biāo)基因存在的真實性，而且表達模式結(jié)果能基本匹配相應(yīng)功能注釋信息。本次轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列信息為光皮

6、樺后續(xù)功能基因組研究奠定了堅實基礎(chǔ)。
　　 3.以轉(zhuǎn)錄組測序獲得的相關(guān)序列為基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)分離到8個光皮樺纖維素合成酶基因BlCesA的全長cDNA序列，對應(yīng)的編碼蛋白分別由985-1,103個氨基酸殘基組成，且每個蛋白都具有植物CESA蛋白特有的基序。8個BlCESA氨基酸序列間一致性交幅為55-82％，而它們與相應(yīng)具最高相似度的毛果楊PtriCESA氨基酸序列間的一致性高達81-92％。進化樹構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn)BlCESA

7、1、BlCESA3和BlCESA4分屬于3個與次生壁形成相關(guān)的類群;BlCESA2、BlCESA5、BlCESA6、BlCESA7和BlCESA8則分屬于3個與初生壁形成相關(guān)的類群。進一步的定量PCR分析，表明BlCesA1、BlCesA3和BlCesA4等3個基因主要在木質(zhì)化莖段的木質(zhì)部表達，且經(jīng)激素和蔗糖處理后，這3個基因的表達變化趨勢完全一致，暗示可能構(gòu)成一種同工型。然而在拉彎處理實驗中，雖然這3個基因在應(yīng)拉區(qū)木質(zhì)部中的表達皆明顯

8、大于對照樣品，但BlCesA4在對應(yīng)區(qū)木質(zhì)部中的表達變化與BlCesA1、BlCesA3不鼠。BlCesA2、8lCesA6和BlCesA7主要在葉片、韌皮部中表達，在功能上可能主要參與初生壁的形成。BlCesA8雖與BlCesA6具有較高序列相似度，但主要在幼葉、韌皮部和形成層表達，且在激素、蔗糖和拉彎處理下兩個基因的表達皆存在一定差異，該基因可能不只是在初生壁的形成中發(fā)揮作用。
　　 4.運用基于RNA-Seq的數(shù)字表達譜技

9、術(shù)對應(yīng)拉木形成早期階段（拉彎處理6h到7d）的應(yīng)拉區(qū)木質(zhì)部（包括對照樣品）進行了基因表達譜分析，共檢測到44，680個Unigenes表達，其中符合篩選條件的差異表達Unigenes有4，567個，涉及至少1，151個代謝途徑。從GO分類結(jié)果看，差異表達Unigenes至少包含40個亞類，且光皮樺拉彎處理總體會導(dǎo)致相關(guān)代謝增強、酶活提高。進一步對21個參與纖維素、木質(zhì)素合成相關(guān)酶編碼基因的表達特征進行分析，共檢測到163個編碼這些酶的U

10、nigenes在該發(fā)育階段表達，其中109個發(fā)生了明顯的表達變化，且76個(69.7％)在次生木質(zhì)部特異或優(yōu)勢表達。纖維素合成途徑中主要酶編碼基因多數(shù)呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達，較好地印證了光皮樺應(yīng)拉木中纖維素含量增加及膠質(zhì)層存在的事實。以部分編碼CesA、 SUS和KOR的Unigenes為指導(dǎo)基因進行基因共表達分析，發(fā)掘到3個可能參與光皮樺應(yīng)拉木形成的MYB和OVATE類轉(zhuǎn)錄因子。在編碼參與苯丙烷途徑主要酶的基因序列中，有多個在次生木質(zhì)部優(yōu)

11、勢表達的Unigenes卻呈現(xiàn)上調(diào)表達;而在木質(zhì)素單體特異途徑中，多數(shù)注釋為CCR、 CAD和SAD的Unigenes表現(xiàn)為明顯的下調(diào)表達，表明應(yīng)拉木中木質(zhì)素含量相對下降可能主要與木質(zhì)素單體途徑中的酶基因有關(guān)。此外，在該應(yīng)拉木形成早期階段，多數(shù)注釋為生長素反應(yīng)因子和誘導(dǎo)蛋白的Unigenes呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達趨勢，而超過半數(shù)的外輸載體基因卻發(fā)生了顯著的上調(diào)表達。
　　 以上研究結(jié)果不僅為光皮樺木材形成分子遺傳基礎(chǔ)的進一步解析奠定