轉(zhuǎn)化山葡萄ICE基因培育抗寒葡萄新種質(zhì)的研究.pdf

1、葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬（Vitis.Linn.），是一種栽培價值很高的果樹。然而葡萄凍害給生產(chǎn)帶來很大損失，因此培育抗寒品種迫在眉睫。ICE基因能編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，其在低溫誘導(dǎo)下能使一系列冷誘導(dǎo)基因COR表達，從而使轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性得到提高。本研究以栽培品種‘美人指’葡萄（NtisviniferaL.‘ManicureFinger'）和砧木品種‘1202'(Mourvedre×Rupestris)葡萄為材料，采用

2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ICE基因?qū)搿廊酥浮咸阎胁D(zhuǎn)基因株系做抗寒鑒定;建立‘1202’葡萄砧木不定芽再生體系并通過花粉管通道法將ICE基因?qū)腚y以轉(zhuǎn)化的‘1202’葡萄砧木中，獲得抗寒性較強的轉(zhuǎn)基因葡萄，以期培育葡萄新種質(zhì)。本研究結(jié)果如下:
　　1.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將從山葡萄中克隆的ICE基因轉(zhuǎn)到‘美人指’葡萄中，經(jīng)過潮霉素篩選，總共獲得5個轉(zhuǎn)基因抗性株系。GUS瞬時表達檢測5個抗性株系，結(jié)果均呈陽性;經(jīng)過PCR檢測，5株GUS

3、陽性株系均檢測到目的條帶;進一步進行RT-PCR檢測，初步證實，有3個生根株系的ICE基因已經(jīng)整合進‘美人指’葡萄的基因組中。
　　2.經(jīng)過前期分子檢測得到的3株美人指轉(zhuǎn)基因葡萄株系，將其做低溫處理并表型分析，從而篩選出最抗寒株系。對最抗寒的株系測定丙二醛(MDA)、可溶性糖(solublesuger)、超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、脯氨酸(praline)等生理指標(biāo)。結(jié)果表明:通過導(dǎo)入IC

4、E基因，植物體內(nèi)的MDA含量減少，SOD、POD、CAT的活性及游離脯氨酸的含量提高，從而轉(zhuǎn)基因葡萄的抗寒能力增強。
　　3.以葡萄砧木‘1202’為試材，研究了不同外植體類型、不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比、外植體放置方式等對其不定芽再生頻率的影響。結(jié)果表明:葉片的再生效果最好，最高再生頻率為68.78％，最適宜葡萄砧木‘1202’不定芽再生的培養(yǎng)基為MS+TDZ1.0mg/L+IBA0.01mg/L+蔗糖30g/L+5.5g/L

5、瓊脂，pH5.8，最適宜葉片放置方式為近軸面接觸培養(yǎng)基。在上述條件下，研究建立起葡萄砧木‘1202’離體不定芽再生體系，再生的葡萄苗40天后移栽，達到90％的成活率。
　　4.以‘1202’葡萄砧木的花序為轉(zhuǎn)化ICE基因的受體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)并結(jié)合花粉管通道法對‘1202’葡萄進行轉(zhuǎn)化，利用GUS染色、PCR和RT-PCR方法檢測，共得到3株GUS陽性株系，3株P(guān)CR陽性株系，1株RT-PCR陽性株系，初步說明已經(jīng)整合ICE基因的‘1