高密度脂蛋白模擬肽Reverse-D-4F改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是危害人類健康最嚴(yán)重的心腦血管疾病之一，故阻止AS的進(jìn)展已成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)課題。人類飲食情況已被證明在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，無論在健康人群還是在心血管患者中，高脂飲食均可誘導(dǎo)其血管功能障礙，降低外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（endoth elial progenitor cells，EPCs）水平，同時(shí)增加白細(xì)胞數(shù)量；最近zhang等研究發(fā)現(xiàn)，Apo A

2、-I模擬肽D-4F會(huì)通過內(nèi)皮一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）信號(hào)通路促進(jìn)EPCs的增殖、遷移和粘附。近期發(fā)現(xiàn)ApoA-I模擬肽reverse-D-4F，按照D-4F氨基酸順序反向排列，通過抑制血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和氧化反應(yīng)，進(jìn)一步降低主動(dòng)脈竇AS斑塊的面積及斑塊巨噬細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)reve rse-D-4F還具有提高HDL（high d

3、ensity lipoprotein，HDL）功能的作用。然而reverse-D-4F對(duì)高脂飲食小鼠外周血細(xì)胞亞群的影響，和對(duì)體內(nèi)和體外EPCs的保護(hù)作用尚不清楚。本研究通過觀察各組小鼠外周血EPCs、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞各亞群的數(shù)量，動(dòng)脈壁炎癥因子水平和祖細(xì)胞的數(shù)量，各組小鼠骨髓源EPCs功能，來研究A poA-I模擬肽reverse-D-4F對(duì)高脂飲食小鼠EPCs數(shù)量和功能的影響及其機(jī)制。
　　1.小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞

4、誘導(dǎo)分化為EPCs的生物學(xué)特性研究
　　比較差速貼壁方法分離的不同時(shí)間點(diǎn)貼壁的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells，MNCs）誘導(dǎo)分化為EPCs的生物學(xué)特性，探討最適宜貼壁時(shí)間。Ficoll密度梯度離心分離小鼠骨髓MNCs，接種于預(yù)先鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板上，定義為1 d貼壁細(xì)胞組，取1d非貼壁細(xì)胞再接種為3d貼壁細(xì)胞組，繼續(xù)培養(yǎng)2d取非貼壁細(xì)胞再接種為3 d非貼壁細(xì)胞組，繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，分別檢測(cè)3組誘導(dǎo)分

5、化EPCs亞群表面標(biāo)志、粘附能力和成血管能力。結(jié)果顯示，1 d貼壁細(xì)胞中CD34+、FLK-1+、CD34+/FLK-1+細(xì)胞數(shù)明顯多于3 d貼壁細(xì)胞和3 d非貼壁細(xì)胞(P<0.01)；1 d貼壁細(xì)胞粘附能力、成血管能力均顯著高于3d貼壁細(xì)胞和3d非貼壁細(xì)胞；1d貼壁細(xì)胞和3d貼壁細(xì)胞eNOS表達(dá)量無顯著差異，但均顯著高于3 d非貼壁細(xì)胞(P<0.01)；3 d貼壁細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial grow

6、th factor，VEGF)表達(dá)水平顯著高于1 d貼壁細(xì)胞和3 d非貼壁細(xì)胞(P<0.01)。以上結(jié)果提示，1d貼壁小鼠骨髓MNCs誘導(dǎo)分化的EPCs生物學(xué)功能顯著高于3d貼壁細(xì)胞和3d非貼壁細(xì)胞；3d貼壁細(xì)胞較1d貼壁細(xì)胞和3d非貼壁細(xì)胞表達(dá)較多的VEGF，1 d貼壁細(xì)胞和3 d貼壁細(xì)胞eNOS表達(dá)高于3 d非貼壁細(xì)胞。小鼠骨髓EPCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)最適宜貼壁時(shí)間為1~3 d。
　　2. Reverse-D-4F提高EPCs功能

7、及其機(jī)制研究
　　載脂蛋白A-I模擬肽抑制apoE敲除小鼠AS的發(fā)展；EPCs可以修復(fù)致AS的因素誘導(dǎo)的受損內(nèi)皮細(xì)胞。本研究探明了apoA-I模擬肽reverse-D-4F對(duì)小鼠骨髓來源晚期EPCs的增殖、遷移和體外成血管功能的影響，發(fā)現(xiàn)reverse-D-4F（10–100 mg/ml）提高了EPCs的增殖、遷移和體外成血管功能，激活了AKT和eNOS，并呈劑量依賴性。LY294002（PI3激酶抑制劑）和L-NAME（一氧化氮

8、合酶抑制劑）明顯抑制reverse-D-4F介導(dǎo)的EPCs增殖、遷移和體外成血管生物學(xué)功能的提高，并且LY294002明顯抑制reverse-D-4F誘導(dǎo)的AKT和eNOS的激活。結(jié)果表明，reverse-D-4F部分通過PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，提高EPCs增殖、遷移和體外成血管功能。
　　3. Reverse-D-4F增加高脂飲食小鼠EPCs數(shù)量和功能及其機(jī)制研究
　　盡管HDL具有改善EPCs的功能，但HDL

9、載脂蛋白AI模擬肽reverse-D-4F對(duì)EPCs的動(dòng)員和損傷修復(fù)仍有待進(jìn)一步研究。本研究觀察了reverse-D-4F對(duì)高脂飲食C57BL/6J小鼠外周血細(xì)胞亞群的影響和reverse-D-4F對(duì)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)EPCs功能受損的改善。發(fā)現(xiàn)高脂飲食顯著降低了EPCs的數(shù)量、遷移和淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中的百分比；然而，也顯著增加了外周血中白細(xì)胞數(shù)量、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞占白

10、細(xì)胞的百分比，和血漿中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和TNF-α的水平。reverse-D-4F明顯抑制高脂飲食對(duì)外周血細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平的影響，增加血漿中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α（stromal cell derived factor1α，SDF-1α）水平。體外研究證明，TNF-α通過抑制AKT和eNOS的活性來抑制EPCs增殖、遷移和體外成血管形成，reverse-D-4F能恢復(fù)上述TNF-α誘導(dǎo)的EPCs的損傷、AKT和eNOS的