氨氯地平對(duì)氧化低密度脂蛋白致大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:氨氯地平對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxLDL)致大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為三組:
　?、賹?duì)照組:加等量含200μmol/L DMSO的全培養(yǎng)液;
　　②oxLDL組(50μg/ml oxLDL)組;
　?、郯甭鹊仄浇M:50μg/ml oxLDL+0.5μmol/L氨氯地平。
　　貼壁法培養(yǎng)分離與培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs),用細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和攝取acLDL和結(jié)

2、合UEA-1三種方法聯(lián)合鑒定EPCs,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,transwell測(cè)定細(xì)胞遷移,明膠粘附法測(cè)定EPCs的粘附,photshop7.0計(jì)算血管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度,顯微鏡下觀測(cè)單個(gè)細(xì)胞克隆大小和克隆數(shù)目,RT-PCR和western blotting分別檢測(cè)一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA水平和蛋白表達(dá)情況,細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)eNOS蛋白在EPCs的表達(dá)和分布情況,并采用DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的量,采用G

3、riess試劑法測(cè)定一氧化氮(NO)水平。
　　結(jié)果:①采用貼壁法能從大鼠骨髓的單個(gè)核細(xì)胞中分離出純度達(dá)70％以上的CD133+/VEGFR-2+雙陽(yáng)性EPCs;
　?、贓PCs在第3d時(shí)可見(jiàn)集落形成單位(CFUs)出現(xiàn),第14d時(shí)可見(jiàn)鋪路石內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)出現(xiàn);
　?、?.5μmol/L氨氯地平可顯著拮抗oxLDL對(duì)EPCs增殖的抑制作用;
　?、蹺PCs經(jīng)50μg/ml的oxLDL處理后,細(xì)胞的遷移能力下降近3

4、倍,而0.5μmol/L氨氯地平可基本恢復(fù)EPCs的遷移能力;
　?、軪PCs經(jīng)50μg/ml的oxLDL處理后,細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降(7.56±0.85比2.3±0.45,P<0.01,n=5),而0.5μmol/L氨氯地平可部分恢復(fù)EPCs的克隆形成能力(5.6±1.54比2.3±0.45,P<0.01,n=5);
　?、轊PCs經(jīng)50μg/ml的oxLDL處理后,細(xì)胞的粘附能力顯著下降(75.02±14.13個(gè)/

5、每個(gè)視野比29.04±8.21個(gè)/每個(gè)視野,P<0.01,n=5),而0.5μmol/L氨氯地平可部分恢復(fù) EPCs的粘附能力(64.12±15.11個(gè)/每個(gè)視野比29.04±8.21個(gè)/每個(gè)視野,P<0.01,n=5);
　?、逧PCs經(jīng)50μg/ml的oxLDL處理后,細(xì)胞的血管樣結(jié)構(gòu)形成能力顯著下降(15.13mm±1.62mm/每個(gè)視野比1.52 mm±0.71 mm/每個(gè)視野,P<0.01,n=5),而0.5μmol/L

6、氨氯地平可顯著恢復(fù)EPCs的血管樣結(jié)構(gòu)形成能力(11.01 mm±2.14 mm/每個(gè)視野比1.52 mm±0.71 mm/每個(gè)視野,P<0.01,n=5)。
　　機(jī)制研究發(fā)現(xiàn):①EPCs經(jīng)過(guò)50μg/ml的oxLDL處理后, eNOS mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào),一氧化氮(NO)顯著減少(24.35±4.62比11.44±1.15),而oxLDL的這種作用可因0.5μmol/L氨氯地平能顯著改善,相對(duì)于oxLDL處理組, eN

7、OS顯著上調(diào)(P<0.01,n=3或 n=5),NO生成顯著增加(18.17.35±1.94比11.44±1.15,P<0.01,n=3);
　?、贓PCs經(jīng)50μg/ml的oxLDL處理后,細(xì)胞的活性氧生成顯著增加(熒光強(qiáng)度為1.00±0.25比2.53±0.32,P<0.01,n=3),而0.5μmol/L氨氯地平可顯著抑制活性氧的生成(熒光強(qiáng)度為2.53±0.32比1.56±0.18,P<0.01, n=3)。
　　結(jié)