柑橘硼運(yùn)輸基因CiNIP5和CiNIP6的克隆和功能鑒定.pdf

1、柑橘是世界范圍內(nèi)普遍種植的一類非常重要的經(jīng)濟(jì)作物，而它在中國(guó)的主要種植區(qū)之一贛南的土壤中嚴(yán)重缺乏硼素，導(dǎo)致柑橘花而不實(shí)或者“猴頭果”，降低了柑橘產(chǎn)量，從而影響果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。硼是植物生長(zhǎng)必需的微量元素，它在土壤中存在的主要形式是B(OH)3，并以中性分子的形式為植物所吸收和運(yùn)輸。植物對(duì)硼素的濃度適應(yīng)范圍比較窄，硼素濃度過(guò)低或過(guò)高對(duì)植物生長(zhǎng)都會(huì)造成不利的影響。在雨水過(guò)多地方如江西贛南地區(qū)，硼素很容易被雨水淋失而使作物出現(xiàn)缺硼癥狀;而在干旱

2、地區(qū)如澳大利亞，因灌溉水含硼量過(guò)高或者施用過(guò)量硼肥而硼在土壤中累積造成植物硼毒害。雖然硼素對(duì)作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值影響非常大，但是目前人們對(duì)硼素的代謝路徑尚不清楚。近期的研究表明，植物中特有的一類水通道蛋白—NIP家族蛋白參了硼素的吸收和運(yùn)輸過(guò)程，NIP家族基因運(yùn)輸硼、甘油等大分子的功能成為研究熱點(diǎn)。目前在擬南芥、水稻、葡萄等作物中已經(jīng)克隆得到與硼吸收和運(yùn)輸有關(guān)的基因，但是在柑橘中還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究利用電子克隆、染色體步移等技術(shù)

3、，從柑橘砧木枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]中克隆了兩個(gè)基因CiNIP5和CiNIP6及他們的啟動(dòng)子，分析了基因編碼的氨基酸序列的保守性和多樣性，研究了他們?cè)阼讱ぶ薪M織特異表達(dá)模式和缺硼、硼毒害脅迫條件下的時(shí)空表達(dá)情況以及啟動(dòng)子區(qū)域存在的關(guān)鍵元件。為了進(jìn)一步的證實(shí)CiNIP5和CiNIP6與硼吸收和運(yùn)輸?shù)年P(guān)系，還對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證工作。本研究最終證實(shí)了柑橘中CiNIP5和CiNIP6分別參與了植株吸收和

4、運(yùn)輸硼的過(guò)程，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高柑橘耐硼脅迫環(huán)境提供了理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1.采用同源克隆技術(shù)從柑橘砧木枳中得到硼運(yùn)輸基因CiNIP5，基因序列包含903bp的開(kāi)放閱讀框，編碼300個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)CiNIP5編碼蛋白質(zhì)分子的分子量為31.0kDa，等電點(diǎn)為8.73。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，CiNIP5屬于水通道蛋白家族中的NIP亞家族，與擬南芥中的AtNIP5;1有高度的相似性。生物信息學(xué)分析表明CiNIP

5、5蛋白具有典型的NPA和Ar/R結(jié)構(gòu)域，可以運(yùn)輸比水分子大的中性小分子物質(zhì)?；虮磉_(dá)分析表明CiNIP5 mRNA主要在枳根部表達(dá)，在莖和葉中的表達(dá)量非常低。低硼脅迫下，CiNIP5 mRNA積累量顯著升高;在高濃度硼脅迫下，CiNIP5 mRNA積累量顯著降低。
　　 2.采用同源克隆技術(shù)從柑橘砧木枳中得到硼運(yùn)輸相關(guān)基因CiNIP6，基因序列包含915bp的開(kāi)放閱讀框，此開(kāi)放閱讀框包含五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子，編碼304個(gè)氨基酸

6、。預(yù)測(cè)CiNIP6編碼蛋白質(zhì)分子的分子量為31.2kDa，等電點(diǎn)為8.61。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明CiNIP6屬于水通道蛋白家族中的NIP亞家族，與擬南芥中的AtNIP6;1有高度的相似性。生物信息學(xué)分析表明CiNIP6蛋白具有典型的 NPA和Ar/R結(jié)構(gòu)域，其中Ar/R組成為T(mén)，I，G和R不同于AtNIP6;1的結(jié)構(gòu)，推測(cè)CiNIP6具有不同于AtNIP6;1的功能?；虮磉_(dá)分析表明CiNIP6 mRNA主要在枳地上部位表達(dá)，

7、在根中的表達(dá)量非常低。在低硼和高硼濃度脅迫下，CiNIP6 mRNA積累量都顯著升高，說(shuō)明CiNIP6參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)硼的平衡分布。
　　 3.應(yīng)用染色體步移技術(shù)克隆得到CiNIP5和CiNIP6基因啟動(dòng)子。生物信息學(xué)分析表明這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子都具有典型的TATA box和CAAT box，并含有很多逆境響應(yīng)元件;如干旱、傷害等，還包含乙烯、赤霉素、生長(zhǎng)素、光等激素和環(huán)境信號(hào)響應(yīng)元件。
　　 4.通過(guò)生物信息學(xué)分析，比對(duì)

8、發(fā)現(xiàn)CiNIP5的5端UTR和AtNIP5;1的5端UTR具有很高的相似性，都具有兩個(gè)保守序列:序列1(CAUGUAA)和序列2(UCAAAUCAUGUAA)。這兩個(gè)序列對(duì)于CiNIP5響應(yīng)環(huán)境中硼濃度而上調(diào)或下調(diào)變化起到?jīng)Q定性作用。
　　 5.通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CiNIP5和CiNIP6基因轉(zhuǎn)入煙草中超表達(dá)進(jìn)行功能分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)CiNIP5基因植株的細(xì)胞耐逆境能力增強(qiáng)，葉片的光合作用增強(qiáng)，根部累積的硼含量顯著增加;轉(zhuǎn)CiNI