落葉松IAA受體基因分離與干細胞極性相關(guān)miR166及其目標基因功能研究.pdf

1、落葉松(Larix spp.)是我國北方和西部高山地區(qū)具有重要經(jīng)濟和生態(tài)價值的針葉樹種，而體細胞胚再生體系是進行落葉松分子遺傳改良的基礎(chǔ)，也是研究裸子植物胚胎發(fā)生機制的理想實驗材料。受基因型和培養(yǎng)條件的影響，落葉松體細胞胚的誘導(dǎo)經(jīng)常出現(xiàn)發(fā)育畸形，阻礙了實驗和生產(chǎn)。生長素及其極性運輸在擬南芥等植物胚胎的形態(tài)建成中扮演重要角色。已經(jīng)有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子HD-ZIPⅢ可能參與生長素的極性運輸過程，且HD-ZIPⅢ為miR166的目標基因。但是

2、在裸子植物體細胞胚發(fā)育過程中，miR166調(diào)控HD-ZIPⅢ，及其與生長素的關(guān)系沒有相關(guān)研究。以落葉松體細胞胚為實驗材料，研究了生長素極性運輸抑制劑N-1-萘基酞氨酸(NPA)和過表達miR166a對體細胞胚發(fā)育的影響，分析了2個生長素受體和4個HD-ZIPⅢ家族成員的基因結(jié)構(gòu)和表達模式，并得到以下結(jié)果:
　　 (1)采用NPA處理，模擬生長素極性運輸被抑制的突變體，研究生長素極性運輸對落葉松體細胞胚發(fā)育的影響。結(jié)果表明，10

3、mg/L的IAA和3 mg/L的NPA處理導(dǎo)致原胚團生長緩慢，胚性胚柄結(jié)構(gòu)消失。成熟培養(yǎng)基中加入3 mg/L的NPA，體細胞胚發(fā)育出現(xiàn)畸形，子葉融合不展開，頂端呈杯狀，胚柄程序化細胞凋亡被延緩，且胚頭的生長受到抑制。利用樹脂半薄切片觀察體細胞胚的顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明NPA處理導(dǎo)致體細胞胚的頂-基胚軸極性無法正常建立，細胞排列紊亂，各組織和器官沒有正確有序的進行分化，胚頭和胚柄的生長平衡被打破。
　　 (2)通過同源克隆獲得了兩個生

4、長素受體基因LaAFB1和LaAFB2，兩者都具有典型的LRR和F-box結(jié)構(gòu)域。LaAFB1的3'端具有miR393結(jié)合位點，其體內(nèi)切割產(chǎn)物通過RLM-5'RACE技術(shù)得到驗證，且切割位點發(fā)生在miR393的第10和13位堿基，表明落葉松LaAFB1受到miR393的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。通過檢索體細胞胚和幼苗的小RNA測序文庫，發(fā)現(xiàn)LaAFB1被切割后能產(chǎn)生次級siRNA，且只存在于幼苗小RNA文庫中，而不存在于體細胞胚的小RNA文庫中，提示

5、miR393介導(dǎo)LaAFB1切割產(chǎn)生的次級siRNA只在落葉松的胚后發(fā)育中發(fā)揮功能。采用qRT-PCR檢測LaAFB1和LaAFB2在落葉松根莖葉等器官和體細胞胚中的表達模式。發(fā)現(xiàn)兩個基因的表達規(guī)律相似，且在成熟體細胞胚中的表達水平最低，表明削弱生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，有利于胚胎的發(fā)育和成熟。
　　 (3)利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得了4個落葉松HD-ZIPⅢ同源基因的全長cDNA，分別命名為LaHDZ31、32、33和34。它

6、們都具有保守的蛋白結(jié)構(gòu)域:HD、START和MEKHLA。在LaHDZ31-34的START中存在miR165/166的核酸互補序列，進一步采用RLM-5'RACE驗證了LaHD Z33和34的體內(nèi)切割產(chǎn)物，且切割位點均位于miR166的第10位堿基，表明在落葉松體細胞胚發(fā)生過程中，LaHDZ31-34受到miR165/166的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。利用qRT-PCR檢測了LaHDZ31-34在正常發(fā)生和NPA處理的體細胞胚中的表達規(guī)律，結(jié)果表明

7、LaHDZ31-34在成熟體細胞胚中的表達量高于原胚團中，且表達最高峰發(fā)生在后期單胚階段。在體細胞胚發(fā)育早期，NPA處理的體細胞胚中LaHDZ31-34的表達量比對照高;而在發(fā)育的后期階段，LaHDZ31-33在NPA處理的體細胞胚中的表達量比對照低，但LaHDZ34的表達不受影響。表明LaHDZ31-34與落葉松體細胞胚極性的形成密切相關(guān)，LaHDZ34在胚胎發(fā)育后期及子葉形成中的功能與其他3個基因不同。
　　 (4)通過qR

8、T-PCR檢測了miR166的兩個前體基因LaMIR166a和LaMIR166b在落葉松根莖葉、正常發(fā)生的體細胞胚和NPA處理的畸形胚中的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)兩個基因的表達模式明顯不同。LaMIR166a在根莖葉中均表達，且在原胚團中的表達水平比成熟體細胞胚中略高;而LaMIR166b在原胚團和葉中不表達，在體細胞胚成熟過程中表達上調(diào)。在體細胞胚成熟過程中，miR166及其目標基因存在共表達現(xiàn)象，但是在體細胞胚發(fā)育后期，LaMIR166a和L

9、aMIR166b的表達受NPA誘導(dǎo)，其目標基因卻受NPA抑制。構(gòu)建Super啟動子驅(qū)動LaMIR166a超表達的轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的落葉松胚性細胞的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了五個抗性細胞系。經(jīng)PCR檢測驗證，五個抗性細胞系均為陽性轉(zhuǎn)基因。對過表達LaMIR166a的轉(zhuǎn)基因體細胞胚的表型和顯微結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果表明過表達LaMIR166a使胚軸伸長受到抑制，影響子葉的發(fā)生和莖頂端分生組織的形態(tài)。
　　 過表達LaMIR166a與NPA