肝癌干細(xì)胞相關(guān)功能性基因的研究.pdf

1、肝癌發(fā)病率位列惡性腫瘤的第5位，死亡率列第3位，世界范圍內(nèi)尤以中國(guó)為著。目前肝癌的治療仍以手術(shù)為主，并配以放、化療，但仍有50-80％的病人因復(fù)發(fā)、耐藥在5年內(nèi)死亡，其原因是這些治療手段只能殺傷普通的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移耐藥的具有自我更新、不定向分化、高致瘤性等特點(diǎn)的腫瘤干細(xì)胞毫無(wú)作用。因此尋找新的、有效的靶向腫瘤干細(xì)胞的治療靶標(biāo)，對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物或治療策略，有效治療導(dǎo)致高死亡率的腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥，具有非常重

2、要的意義。
　　本室在前期工作中通過(guò)大容量功能性單抗庫(kù)/蛋白質(zhì)組學(xué)反向篩選技術(shù)篩選獲得一株靶向肝癌干細(xì)胞的功能性單克隆抗體11C9，通過(guò)免疫親和層析獲得其靶抗原，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為H蛋白。
　　本研究中首先通過(guò)免疫共沉淀、細(xì)胞免疫熒光共定位及基因沉默對(duì)獲得的H蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果均證實(shí)11C9單抗識(shí)別的抗原蛋白是H蛋白，該蛋白可少量表達(dá)于細(xì)胞膜表面。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H蛋白在人肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)比例分別為71.8％和8.

3、3％，顯著上調(diào)表達(dá)(p＜0.01)，且與肝癌的轉(zhuǎn)移(p＜0.05)、分化程度(p＜0.05)和生存期(p＜0.01)顯著相關(guān)，還是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子(p＜0.05)，提示H蛋白的上調(diào)表達(dá)與肝癌惡性程度密切相關(guān)。
　　無(wú)血清懸浮培養(yǎng)可以富集腫瘤干細(xì)胞。人肝癌細(xì)胞MHCC97L親本、sphere細(xì)胞成球率為16.4％和23.2％，BEL7402親本、sphere細(xì)胞的成球率27.2％和37.4％，證明這兩株細(xì)胞中含有腫瘤干細(xì)胞且能被富

4、集。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)H蛋白在MHCC97L、BEL7402親本細(xì)胞膜表面的表達(dá)陽(yáng)性比例為2.25％、1.78％，而在sphere細(xì)胞中的表達(dá)陽(yáng)性比例為17.8％，7.19％，分別富集了7.9倍和4倍。采用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選MHCC97L細(xì)胞中膜表面陽(yáng)性的H+細(xì)胞及陰性的H-細(xì)胞，在甲基纖維素中進(jìn)行無(wú)血清成球?qū)嶒?yàn)，順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示H+MHCC97L細(xì)胞成球率為23.6％，H-細(xì)胞為15

5、.6％(p＜0.01)。H+細(xì)胞順鉑耐藥的IC50為0.98μg/ml，H-細(xì)胞為0.51μg/ml。H+細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)為302±14.6，H-細(xì)胞為236±14.8(p＜0.01)。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示兩株細(xì)胞中H+細(xì)胞2×102/只接種8-10周出瘤，H-細(xì)胞2×104/只接種8周出瘤。以上結(jié)果證明細(xì)胞膜高表達(dá)H蛋白的H+癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、侵襲、耐藥、動(dòng)物體內(nèi)致瘤能力等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的顯著特征。
　　MHCC97L細(xì)胞

6、中CD90+細(xì)胞成球率為29.2％，在親本及sphere細(xì)胞中的表達(dá)比例為2.37％、7.06％; BEL7402細(xì)胞中ESA+細(xì)胞成球率為41.2％，親本及sphere細(xì)胞中的表達(dá)比例為2.6％、18.7％，兩種標(biāo)志物均表現(xiàn)為肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物。H蛋白與MHCC97L中CD90+細(xì)胞、BEL7402中ESA+細(xì)胞共陽(yáng)性染色的比例分別為57.1％，40.9％。并且完整腫瘤干細(xì)胞球細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示H蛋白能夠與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD90

7、及PKH26共陽(yáng)性染色。表明H蛋白在肝癌干細(xì)胞膜表面上調(diào)表達(dá)，提示H蛋白是肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因（/蛋白）。
　　分選MHCC97L細(xì)胞中CD90+ H+、CD90+H-、CD90-H+，CD90-H-細(xì)胞進(jìn)行甲基纖維素成球?qū)嶒?yàn)、耐藥實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示四組細(xì)胞的成球率分別為28％、15.6％、10.6％、5.4％，順鉑耐藥IC50分別為1.18μg/ml，0.88μg/ml，0.69μg/ml，0.31μg/ml，侵襲細(xì)胞數(shù)分別

8、為419±22，319±16.6、202±16.9、117±14.1。顯示在CD90+肝癌干細(xì)胞亞群中，H+肝癌干細(xì)胞的自我更新、侵襲、耐藥能力依然顯著強(qiáng)于H-肝癌干細(xì)胞。上述結(jié)果表明表達(dá)于細(xì)胞膜表面的H蛋白在促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新、侵襲、耐藥、動(dòng)物體內(nèi)致瘤等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特征功能方面可能發(fā)揮了重要的作用，并可能成為一個(gè)潛在的、新的肝癌干細(xì)胞分子標(biāo)志物。
　　11C9功能性抗體抑制H蛋白后體外功能研究顯示，成球率由26.6％降為

9、4.2％，(p＜0.01)，順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)顯示IC50由1.5μg/ml降為0.8μg/ml，侵襲穿過(guò)細(xì)胞由368±10.9降為124±6.7。提示干擾抑制表達(dá)于細(xì)胞膜表面的H蛋白的功能，可顯著抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新、侵襲、耐藥能力等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)功能，表明表達(dá)于細(xì)胞膜表面的H蛋白在促進(jìn)肝癌腫瘤干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)功能中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。
　　為進(jìn)一步研究H基因在腫瘤干細(xì)胞中的功能，采用siRNA干擾、小分子抑制干預(yù)H蛋白進(jìn)行

10、體外功能實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA干擾后，干擾組成球率為17.4％，未干擾組為24.4％(p＜0.01)。順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)顯示IC50由未干擾組的1.24μg/ml降為0.79μg/ml，CD90+腫瘤干細(xì)胞比例由4.04％降為1.89％，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞由未干擾組的362±23降為260±24.5(p＜0.01)。小分子抑制劑處理后體外功能顯示，成球率由21.8％降為9.8％(p＜0.01)，順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)IC50由1.13μg/m

11、l降為0.65μg/ml，侵襲穿過(guò)細(xì)胞數(shù)由376±22.8降為117±22.4，CD90+腫瘤干細(xì)胞比例由4.36％降為1.22％。上述結(jié)果進(jìn)一步確證，抑制H基因的表達(dá)或干擾阻斷H蛋白的生物學(xué)功能可顯著抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新、侵襲、耐藥能力等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)功能。
　　體外對(duì)MHCC97L親本細(xì)胞進(jìn)行H基因的siRNA干擾、小分子抑制劑、11C9單抗處理的結(jié)果顯示，siRNA干擾及小分子處理對(duì)親本細(xì)胞增的殖抑制強(qiáng)于抗體干預(yù)，

12、以小分子抑制劑最強(qiáng)。結(jié)合前述結(jié)果，提示表達(dá)于細(xì)胞膜表面的H蛋白相對(duì)可能是一個(gè)更特異地靶向肝癌干細(xì)胞的靶向治療新靶點(diǎn)。
　　流式細(xì)胞分選MHCC97L中CD90+H+細(xì)胞，經(jīng)11C9功能性抗體處理后進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，顯示SOX2、Stat3等干性、運(yùn)動(dòng)、耐藥相關(guān)基因及GSK-3β、β-catenin等Wnt信號(hào)相關(guān)通路基因下調(diào)。Western-blot檢測(cè)顯示，小分子抑制劑處理MHCC97L細(xì)胞后，H蛋白的表達(dá)未出現(xiàn)明顯改變，磷酸

13、化GSK3β水平下降，磷酸化β-catenin水平增加，β-catenin的表達(dá)減少。提示膜型H蛋白可能通過(guò)上調(diào)GSK-3β的磷酸化，進(jìn)而抑制β-catenin的磷酸化和β-catenin的降解，上調(diào)β-catenin蛋白的量，從而參與Wnt信號(hào)通路激活，發(fā)揮對(duì)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)功能如自我更新、侵襲、耐藥等特性的調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，本研究鑒定了通過(guò)大容量功能性單抗庫(kù)/蛋白質(zhì)組學(xué)反向篩選鑒定技術(shù)篩選獲得肝癌干細(xì)胞功能性H蛋白/基