油菜高親和磷轉運蛋白基因BnPht1;4的功能研究.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，它既是植物體內(nèi)許多重要有機化合物的組分，同時又參與植物體內(nèi)多種代謝過程，如碳水化合物代謝、氮素代謝、脂肪代謝等。植物對土壤中磷素的吸收主要以無機磷(Pi)的形式。土壤對磷的強烈吸附使土壤溶液中植物可吸收的可溶性無機磷的含量非常低。研究高效吸收和利用土壤磷素營養(yǎng)能力的分子機制，可能為了解高等植物復雜的磷素吸收和轉運提供了有價值的科學資料。而且，克隆鑒定高親和磷轉運蛋白基因，并研究揭示其功能，具有重

2、要的生物學理論意義和潛在的農(nóng)業(yè)利用價值。本研究從油菜中克隆了一個高親和磷轉運蛋白基因，命名為BnPht1;4，對該基因在植物低磷應答中的功能進行了分析，主要研究結果如下:
　　1.BnPht1;4基因的分離鑒定和特征分析
　　從油菜cDNA文庫中克隆了一個cDNA序列，其開放閱讀框(openreadingframe，ORF)為1605bp，編碼532個氨基酸。序列分析預測該基因編碼的蛋白與擬南芥中的高親和磷轉運蛋白AtPht

3、1;4具有95％的相似性，因此將該基因命名為BnPht1;4。
　　2.BnPht1;4蛋白的亞細胞定位分析
　　為了確定BnPht1;4蛋白的亞細胞定位，我們構建了融合表達載體BnPht1;4-GFP，利用基因槍轉化洋蔥表皮細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在質(zhì)膜上。拓撲學分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有12個跨膜區(qū)域，在第6和第7個跨膜區(qū)域間被分成兩組。
　　3.BnPht1;4的組織表達分析
　　為了研究BnPh

4、t1;4在正常條件和低磷條件下在油菜中的表達模式，我們提取了油菜根、下胚軸、子葉、莖、葉和花等不同組織的總RNA，進行RT-PCR分析。正常磷處理時，該基因在莖和花中的表達量較高;用低磷處理時，在根中的表達量顯著上調(diào)，并且在處理12h后，其表達量急劇增加。
　　4.BnPht1;4啟動子分離及活性分析
　　從油菜基因組DNA中分離了BnPht1;4啟動子，大小為1276bp。利用PlantCARE程序對該序列分析發(fā)現(xiàn)，它含有

5、2個P1BS和2個W-box結合基序，GARE、TGA、TCA和ABRE等激素應答元件，及MBS和LTR非生物脅迫應答元件。
　　將BnPht1;4啟動子構建到GUS融合表達載體中進行擬南芥的遺傳轉化，對篩選出的陽性苗進行GUS活性分析發(fā)現(xiàn)，當蔗糖達到一定濃度時，用低磷處理后，在根部發(fā)現(xiàn)較強的GUS信號，說明該基因受低磷誘導，并且依賴于蔗糖的存在。
　　5.過量表達BnPht1;4影響擬南芥根發(fā)育
　　將BnPht1;

6、4構建到過量表達載體上，導入擬南芥，獲得轉基因植株，進行表型分析。在正常磷處理下，過量表達BnPht1;4轉基因擬南芥與野生型相比，根和地上部分都沒有明顯差異;經(jīng)低磷(50μMPi)處理后，轉基因植株的鮮重高于野生型，主根的伸長顯著長于野生型;盡管轉基因植株的側根的密度少于野生型，但是側根數(shù)目多于野生型;無機磷含量的測定也得出過量表達在地上部分和根中都高于野生型。
　　6.低磷應答下BnPht1;4受PHR1轉錄因子調(diào)控
　

7、　分析發(fā)現(xiàn)BnPht1;4啟動子含有兩個PHR1結合元件P1BS，前期研究表明PHR1能與BnPht1;4啟動子相互作用，調(diào)控BnPht1;4表達。為進一步分析這兩個P1BS結合元件在BnPht1;4低磷誘導中的重要性，分別對這兩個元件進行缺失突變，構建了單P1BS和雙P1BS突變的重組載體BnPht1;4PM1∶GUS,BnPht1;4PM2∶GUS和BnPht1;4PMM∶GUS，轉化擬南芥。對篩選出的轉基因擬南芥進行低磷處理，觀察

8、GUS活性。組織化學染色分析發(fā)現(xiàn)，低磷處理后，單P1BS突變(BnPht1;4PM1和BnPht1;4PM2)后BnPht1;4啟動子低磷誘導活性下降。在轉基因擬南芥中雙P1BS突變(BnPht1;4PMM)后BnPht1;4啟動子低磷誘導活性并沒有完全消失，這暗示在低磷應答時，除了PHR1，可能還存在其它轉錄因子對BnPht1;4進行調(diào)控。
　　7.BnPht1;4可能受WRKY75轉錄因子調(diào)控
　　擬南芥中WRKY家族的