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文檔簡介
1、鉀(K)是植物生長發(fā)育必需的大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一,廣泛參與植物的各種生理和生化過程,如植物的細(xì)胞膨壓和滲透壓調(diào)節(jié)、氣孔開閉、離子平衡、酶的活化、抵御生物和非生物脅迫等。由于鉀在土壤中容易被固定淋失、農(nóng)作物秸稈的收獲帶走一部分鉀和長期大量的使用氮、磷肥而鉀肥施用量不足,造成我國土壤中普遍缺鉀,嚴(yán)重限制農(nóng)業(yè)發(fā)展。植物吸收鉀離子存在高、低親和兩種吸收機(jī)制。在高鉀環(huán)境下,鉀離子通道(K Channels)起主要作用,而低鉀環(huán)境下,鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
2、(K Transporters:KT)則發(fā)揮主要作用。植物在應(yīng)對低鉀脅迫時,已經(jīng)進(jìn)化出包括細(xì)胞膜的超極化反應(yīng)、根系構(gòu)型變化、增強(qiáng)鉀在不同組織中的流動、細(xì)胞外酸化和誘導(dǎo)高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KUP/HAK/KT(K UptakePermease/High Affinity K transporter/K Transporters)的表達(dá)等形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和生理生化上的響應(yīng)機(jī)制以提高對鉀的吸收和再利用。已有研究結(jié)果表明,KUP/HAK/KT是組成水稻中
3、最大的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,預(yù)測水稻HAK家族有27個成員,在我們的研究開始之際,國際上還沒有關(guān)于該家族成員在水稻中的表達(dá)特征和生理功能的報(bào)道。因此,開展對水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生理功能研究,對于揭示水稻在低鉀脅迫下的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)鉀素營養(yǎng)的生理、分子機(jī)制和培育鉀高效利用水稻新品種具有重大意義。
本研究以模式作物水稻為研究對象,深入研究水稻高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsHAK5的生理功能,我們對該基因表達(dá)模式的研究、組織和亞細(xì)胞定位、異
4、源系統(tǒng)的功能鑒定,以及該基因超表達(dá)和敲除材料獲得與表型分析等一系列具體的分子和生理試驗(yàn),獲得主要研究結(jié)果如下:
1、OsHAK5基因的表達(dá)模式研究表明,該基因受缺鉀誘導(dǎo)上調(diào)。啟動子融合GUS報(bào)告基因結(jié)果表明,OsHAK5在根表皮、側(cè)根原基、側(cè)根、中柱細(xì)胞、根莖結(jié)合部、葉片、花藥、胚、種子和種殼都有表達(dá),且在根、根莖結(jié)合處和葉片受缺鉀誘導(dǎo),表達(dá)增強(qiáng)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示OsHAK5是一個定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。啟動子分割試驗(yàn)結(jié)
5、果表明:OsHAK5基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游-1479到-1776bp范圍內(nèi)可能存在受缺鉀誘導(dǎo)的順式作用元件(cis-element)。OsHAK5表達(dá)受不同植物激素的誘導(dǎo)(上調(diào)或下調(diào)),且在ATG上游-1479到-1776bp范圍內(nèi)有響應(yīng)生長素信號的順式作用元件ASF1MOTIFCAMV,外源添加IAA處理,顯著增強(qiáng)OsHAK5啟動子融合的GUS基因在不同組織的表達(dá)活性。
2、通過構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-OsHAK5,
6、以空載體pYES2作對照,將其分別轉(zhuǎn)入鉀離子吸收缺陷型酵母突變菌株R5421和鹽敏感型酵母突變菌株AXT3中,以驗(yàn)證OsHAK5在酵母異源體系中的功能,酵母打點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果表明:在高鉀濃度(20 mM K+;50 mM K+)的固體培養(yǎng)上,OsHAK5轉(zhuǎn)化子和空載體生長無明顯差異,而在低鉀(0.05 mM K+到1 mM K+)培養(yǎng)基上,OsHAK5轉(zhuǎn)化子酵母的生長能力顯著優(yōu)于空載體酵母。在高鹽濃度的培養(yǎng)基上,OsHAK5轉(zhuǎn)化子酵母比空載體
7、酵母具有更強(qiáng)的耐鹽能力,通過對液體培養(yǎng)的酵母進(jìn)行高鹽處理然后進(jìn)行鉀、鈉離子含量測定結(jié)果表明:OsHAK5轉(zhuǎn)化子酵母比空載體酵母在高鹽處理下積累更多的K+而不提高Na+吸收,因此,OsHAK5在酵母中表現(xiàn)為高親和鉀選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)體。
3、一定時間的低K(0.3 mM K+)和不加K(0 mM K+)水培試驗(yàn)研究表明:OsHAK5超表達(dá)材料的生物量、地上部K濃度、K吸收總量和單位時間的K凈吸收速率均顯著高于野生型材料,有趣的是,根中K
8、濃度反而顯著低于野生型材料。OsHAK5突變體材料的生物量、K吸收總量和單位時間鉀離子凈吸收速率顯著降低,而根部的K濃度顯著高于野生型材料。正常供鉀時,超表達(dá)和野生材料生長沒有差異,而突變體材料生長受阻的表型不能通過高鉀恢復(fù)。為了進(jìn)一步證明OsHAK5參與水稻根系在低K環(huán)境中吸收K的生理功能,利用NMT(非損傷原位測定技術(shù))測定了OsHAK5超表達(dá)、沉默和野生型水稻根尖鉀離子吸收流速。在正常供K(1 mMK+)時,OsHAK5超表達(dá)和沉
9、默材料及其對應(yīng)的野生型水稻材料根系鉀離子吸收流速無明顯差異,而低K(0.1 mM K+)處理時,超表達(dá)材料鉀離子吸收流速較野生型顯著提高,而突變體材料顯著降低。此外,傷流液試驗(yàn)結(jié)果表明,在低K和完全缺K處理時,超表達(dá)材料傷流液中的K濃度和K外流速率顯著高于野生型,而突變體材料則呈相反趨勢。我們的研究結(jié)果表明在低鉀條件下,OsHAK5不僅有助于水稻對K的吸收,還能增強(qiáng)其地下向地上的轉(zhuǎn)運(yùn)。
4、OsHAK5基因在鹽脅迫中的生理功能
10、研究結(jié)果表明,在鹽脅迫(100mMNaCl)處理下,超表達(dá)材料的生物量、K吸收總量和地上部的K+/Na+均顯著高于野生型,抗鹽脅迫能力增強(qiáng)。與野生型相比,突變體植株地上部的Na+濃度和Na+/K+顯著增高,而生物量和K吸收總量顯著降低,抗鹽能力減弱。這一結(jié)果也驗(yàn)證了我們對酵母試驗(yàn)的結(jié)論。
5、對OsHAK5超表達(dá)和敲除水稻植株的表型分析發(fā)現(xiàn),OsHAK5影響了水稻株型具體表現(xiàn)為:與野生型材料相比,超表達(dá)材料總分蘗和有效分蘗較野
11、生型顯著增加,而突變體材料總分蘗和有效分蘗顯著減少,超表達(dá)和突變體材料的株高都顯著降低。超表達(dá)、突變體和野生型材料根尖和根莖結(jié)合部生長素含量測定結(jié)果表明,OsHAK5超表達(dá)和沉默材料的根尖生長素含量只有對應(yīng)野生型材料的50%,超表達(dá)材料根莖結(jié)合部生長素含量顯著高于野生型,而沉默材料呈相反趨勢。OsHAK5的超表達(dá)和沉默影響了水稻植株生長素輸出載體蛋白PIN家族成員相關(guān)基因和輸入蛋白AUX1的表達(dá),同時也影響了分蘗數(shù)(OsFC1)和分蘗角
12、度(OsLazy1; OsTAC)相關(guān)基因的表達(dá)且超表達(dá)材料和沉默材料的表達(dá)變化呈現(xiàn)相反的趨勢。此外,OsHAK5還影響了[3H]-IAA在水稻植株中的極性運(yùn)輸。不同pH值處理下的根系生長試驗(yàn)結(jié)果表明,在pH值為4.5的處理下,超表達(dá)根系生長顯著優(yōu)于野生型,而當(dāng)pH值為5.5和6.5處理下,超表達(dá)和野生型根系無明顯差異,而沉默材料根系在pH值為4.5、5.5和6.5均表現(xiàn)根系生長受阻現(xiàn)象,尤其在pH4.5處理下根系生長受阻更加嚴(yán)重。推測
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