小麥磷轉運蛋白基因TaPHT21和TaPT2介導植株吸收利用磷素的生物學功能研究.pdf

1、植物磷轉運蛋白(PT)在介導植株對介質中磷素(Pi)吸收以及植株體內Pi在細胞、組織間跨膜轉運中發(fā)揮著重要生物學功能。本項研究針對迄今小麥PT基因克隆、分子特征分析、生化特征鑒定和生物學功能研究較少的現(xiàn)狀，以作者所在試驗室前期構建的富集葉片豐磷基因和根系低磷基因的cDNA差減文庫為基礎，克隆了1個歸屬于PHT2家族的小麥PT基因TaPHT2;1和1個歸屬于PHT1家族的小麥PT基因TaPT2。采用現(xiàn)代分子生物學技術，對上述基因的分子特征

2、及其對植株磷素營養(yǎng)的調控特性進行了研究。主要研究結果如下。
　　1.TaPHT2;1與已報道部分植物種屬PHT2家族基因具有較高同源性，為PHT2家族成員。cDNA全長為2094 bp，開放閱讀框(ORF)1707 bp，編碼557個氨基酸。該基因編碼蛋白TaPHT2;1含有12個保守跨膜域，保守域7和保守域8之間具有1個較大親水區(qū)。
　　2.TaPHT2;1呈葉片優(yōu)勢表達特征，且受到低磷脅迫誘導，根系中該基因表達水平在豐、

3、缺磷條件下均明顯低于葉片。此外，該基因的表達還呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律特征，表現(xiàn)為進入光期后，隨著光期進程該基因的表達水平不斷增強;進入暗期后，該基因表達水平隨著暗期進程不斷減弱。
　　3.用TaPHT2;1和綠色熒光蛋白基因(GFP)的融合基因轉化煙草和小麥，進一步對融合蛋白在葉片亞細胞水平上的定位檢測發(fā)現(xiàn)，該小麥PT定位在葉綠體被膜上，采用遺傳轉化技術，用TaPHT2;1的開放閱讀框(ORF)遺傳轉化缺失高親和磷轉運蛋白系統(tǒng)功能的酵

4、母突變體，證實該小麥PT基因具有補償突變體酵母Pi吸收的功能。上述結果表明，TaPHT2;1在介導胞質和葉綠體間的Pi轉運中可能發(fā)揮著重要功能。
　　4.在構建反義表達TaPHT2;1雙元表達載體基礎上，采用農桿菌介導方法遺傳轉化小麥幼胚外植體，建立了下調表達該小麥PT基因的轉基因系植株。對典型TaPHT2;1下調轉基因系（Line2和Line5）植株和野生型(WT)在豐磷（2 mmol/L Pi）和缺磷(100μmol/L Pi

5、)條件下的植株生長特征、含磷量和光合參數研究表明，與WT相比，豐、缺磷條件下下調表達TaPHT2;1植株的葉綠體Pi濃度顯著下降，表明該小麥PT成員在調控胞質中Pi向葉綠體的轉運過程中發(fā)揮重要作用。此外，與WT相比，供試豐、缺磷條件下下調表達TaPHT2;1轉基因株系的光合能力下降，植株全磷含量降低，單株磷累積量減少，植株長勢變差。
　　5.研究發(fā)現(xiàn)，下調表達TaPHT2;轉基因植株豐、缺磷條件下的單株磷累積量均明顯低于WT，表明

6、該小麥PT基因不僅參與細胞內胞質與葉綠體間的Pi轉運，而且也是植株體內Pi信號通路的重要組分，參與對其他PT成員吸收介質中Pi及轉運組織間Pi的調控。
　　6.TaPT2與部分植物種屬PHT1家族成員高度同源，為小麥PHT1家族基因。該基因的全長cDNA為1802 bp，編碼多肽鏈的氨基酸殘基數量為525個，編碼蛋白的分子量為57.5 kDa，等電點為8.65?？缒び蝾A測分析結果表明，TaPT2含有12個保守跨膜域，該翻譯蛋白經內

7、質網分選后靶向細胞質膜。
　　7.采用PCR技術擴增了TaPT2的編碼閱讀框序列，利用DNA重組技術將其融合至酵母表達載體，進一步轉化缺失高親和磷轉運蛋白酵母突變體MB192。結果表明，TaPT2具有補償MB192在低磷脅迫下Pi吸收的功能。
　　8.TaPT2的表達呈典型的根系優(yōu)勢表達且表達水平受到低磷脅迫的明顯誘導。采用DNA重組技術，構建了將TaPT2開放閱讀框分別以正義和反義方式融合至表達載體的表達框，利用農桿菌介導

8、的遺傳轉化技術建立上、下調表達TaPT2的轉基因植株。
　　9.以野生型植株和典型上、下調表達TaPT2的轉基因株系植株為材料，通過設置豐、缺磷處理水培試驗，研究了遺傳轉化TaPT2對植株抵御低磷逆境的影響。結果表明，豐磷條件下，與WT相比，上、下調表達TaPT2轉基因株系植株的單株干重、全磷含量、單株磷累積量和葉片光合參數沒有改變;低磷脅迫下，與WT相比，下調表達TaPT2轉基因植株的單株干重、全磷含量、單株磷累積量和葉片光合能

9、力下降，而上調表達TaPT2的轉基因植株的單株干重、全磷含量、單株磷累積量和葉片光合能力則較WT顯著增高。表明，TaPT2是一個高親和PTH1家族成員，在調控低磷下植株磷素的吸收具有重要功能。
　　10.本研究表明，TaPHT2;1和TaPT2分別是小麥PHT2和PHT1家族成員，分別在介導葉片細胞胞質中Pi向葉綠體轉運和介導植株對低磷逆境下Pi吸收中發(fā)揮著重要生物學功能。上述基因在小麥資源和種質的磷效率評價和新型磷高效種質（品種