蠟梅兩種分子標(biāo)記的開發(fā)及F1代雜交群體分離方式的評價(jià).pdf

1、蠟梅（Chimonanthuspraecox）是蠟梅科蠟梅屬植物，原產(chǎn)于中國的一種觀花灌木，栽培歷史悠久，歷來受到人們的喜愛。蠟梅花期在冬末春初，異花傳粉，主要的繁殖方式是種子繁殖，為二倍體植物(2n=22)，自然分布的區(qū)域大多在中國東南部，其它地區(qū)分布較少?？v觀蠟梅的研究，主要集中在栽培繁殖、品種分類、種質(zhì)資源及園林應(yīng)用等方面，不過近幾年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對蠟梅在分子水平的研究逐漸增多，比如基因克隆、分子標(biāo)記等方面，這就給蠟梅的

2、研究提供了更大的發(fā)展空間。
　　本研究主要利用蠟梅轉(zhuǎn)錄組測序庫里面的信息，對蠟梅的SSR分子標(biāo)記和SNP分子標(biāo)記進(jìn)行了開發(fā)，并利用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)兩株優(yōu)良單株H29和H64作為親本構(gòu)建了一個(gè)雜交F1代群體，并在“雙假測交”理論的指導(dǎo)下，利用SSR分子標(biāo)記對此雜交F1群體的分離方式進(jìn)行了評價(jià)，為以后蠟梅的遺傳圖譜構(gòu)建打下基礎(chǔ)。同時(shí)利用開發(fā)出來的SNP分子標(biāo)記對華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)隨機(jī)選取的12份蠟梅材料進(jìn)行了分析。
　　本研究

3、的主要研究成果如下:
　　1.SSR分子標(biāo)記的開發(fā)以及對雜交F1代群體分離方式的評價(jià)
　　借助于蠟梅轉(zhuǎn)錄組測序庫中關(guān)于SSR標(biāo)記的信息，從中隨機(jī)挑選出160對引物進(jìn)行合成，經(jīng)過對H29和H64基因組DNA的擴(kuò)增檢驗(yàn)，最終挑選出6對擴(kuò)增條帶清晰且具有多態(tài)性的條帶。
　　優(yōu)化了SSR-PCR擴(kuò)增體系，對不同體系、退火溫度、不同研磨法提取DNA以及上樣量這些因素進(jìn)行了對比分析，研究結(jié)果顯示:20μL反應(yīng)體系中，上下引物（10

4、μmol/L）各1μL、模板DNA(100ng/mol)、2×PCRMix10μL（東盛科技，3mMMgCl2，0.4mMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶），雙蒸水補(bǔ)足為最佳體系;退火溫度影響擴(kuò)增結(jié)果，針對不同的引物篩選了最適的退火溫度;SSR標(biāo)記擴(kuò)增程序?qū)δ０錎NA質(zhì)量要求不高;上樣量在2～4μL/孔時(shí)條帶均勻清晰，易于譜帶識別。
　　利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)和篩選出的6對引物，對雜交F1代群體分離方式進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示:擴(kuò)增

5、出來的SSR標(biāo)記有35個(gè)，其中多態(tài)性標(biāo)記有27個(gè)，在α=0.05水平上，有8個(gè)標(biāo)記符合1∶1分離比例，占總條帶的22.9％，不分離帶和偏分離帶各12個(gè)，占34.3％，而異常分離帶3個(gè)，占8.6％。
　　2.SNP標(biāo)記的開發(fā)
　　經(jīng)過比對1000多個(gè)SNP信息位點(diǎn)，設(shè)計(jì)符合要求的CAPS引物，對12個(gè)蠟梅材料進(jìn)行擴(kuò)增，篩選能夠轉(zhuǎn)化成CAPS標(biāo)記的SNP位點(diǎn)。結(jié)果顯示:共設(shè)計(jì)出42對符合要求的引物，最終只有13個(gè)SNP位點(diǎn)成功轉(zhuǎn)

6、化成CAPS標(biāo)記。
　　13條引物對12個(gè)蠟梅材料進(jìn)行擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切，分析結(jié)果顯示:平均雜合度(AveHet)在0.3000～0.5000之間，雜合度較高;香濃信息指數(shù)(I)大部分都達(dá)到了0.6000以上;而多態(tài)性信息含量(PIC)介于0.25和0.5之間，表現(xiàn)出中多態(tài)性。
　　對11份蠟梅材料進(jìn)行聚類分析，11份蠟梅材料明顯的被分為兩個(gè)類群，H29、M、Z23、柳葉蠟梅、亮葉蠟梅聚為一大類，而H64、L1、L2、L