妊娠早期葉酸缺乏對仔豬骨骼肌mRNA表達譜的影響及其表觀遺傳機制研究.pdf

1、孕期葉酸缺乏(folate deficiency, FD)能夠引起胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growthretardation，IUGR)，而骨骼肌發(fā)育不良是IUGR的主要表征。然而，葉酸缺乏對骨骼肌發(fā)育的影響及其分子機制還不明確。近年來，提高肉質(zhì)水平已成為21世紀養(yǎng)豬業(yè)及育種專家新的攻關(guān)方向;在人類孕前孕后補充葉酸對后代的長遠影響已受到專家的質(zhì)疑并將成為新的研究熱點。本研究探討葉酸的缺乏及補充對骨骼肌形成及發(fā)育的影響

2、，旨在為肉質(zhì)改善和臨床葉酸營養(yǎng)提供有力的實驗支持。首先，我們以豬為動物模型，觀察孕早期葉酸缺乏對仔豬骨骼肌性狀及mRNA表達譜的影響。在我們的研究中，全同胞關(guān)系的長白豬與萊蕪豬作為雜交體系，在懷孕0-6個月喂養(yǎng)葉酸缺乏飼料或正常飼料，觀察初生仔豬背最長肌(Longissimus dorsi，LD)性狀并收集標本，用4×44K Agilent豬芯片進行表達譜檢測。無論在正交組（LR♂×LW♀）還是反交組（LW♂×LR♀），葉酸缺乏組出生仔

3、豬體重均低于正常對照組，而對仔豬體長體高無顯著影響;葉酸缺乏組仔豬肌纖維密度降低，LD中甘油三酯含量更高。芯片結(jié)果顯示在LR♂×LW♀葉酸缺乏組與對照組比較，子代LD中有3154個基因差異表達，而反交組有3885個差異基因（differentially expressed genes，DEGs）;結(jié)果還表明在正反交之間葉酸主要通過影響不同的差異基因而發(fā)揮作用。功能分析表明，孕期母豬葉酸缺乏影響了仔豬LD中幾乎所有的生物學過程;GO與KE

4、GG篩查出脂肪發(fā)育及脂代謝相關(guān)的基因與通路，說明母豬葉酸缺乏可能通過調(diào)控相關(guān)基因而影響了仔豬的脂肪沉積。
　　另一方面，C2C12細胞株在低血清誘導條件下能夠分化為多核的肌管，是體外研究成肌細胞增殖和分化的首選模型。我們以C2C12為模型，分別研究葉酸對成肌細胞增殖及分化的影響并探討其可能的機制。C2C12培養(yǎng)于乏葉酸培養(yǎng)基D2429中來觀察葉酸對肌形成的影響。根據(jù)葉酸濃度分成三個組:葉酸缺乏組(Folate-0mg/l，L)，正

5、常葉酸濃度組(Folate-4mg/l，N)及高葉酸濃度葉酸組(Folate-40mg/l，H)。我們首先研究葉酸對C2C12增殖及分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏能夠促進C2C12細胞增殖而抑制其分化，而高濃度葉酸能促進C2C12的增殖及分化。在C2C12增殖過程中，正常組MyoD mRNA表達明顯高于葉酸缺乏與高濃度葉酸組(P＜0.05)。通過亞硫酸鹽測序（bisulphite sequencing，BS）發(fā)現(xiàn)MyoD轉(zhuǎn)錄起始位點（Tr

6、anscription start site，TSS）上游-16bp to+26bp中的5個CpG位點在H組高甲基化，在N組低甲基化。在C2C12分化過程中，我們發(fā)現(xiàn)隨著葉酸濃度的升高Myogenin mRNA表達增強;在檢測的-374bpto+6bp380bp中，靠近TSS的第7和第8 CpG位點在高H組高甲基化，而在L組第5和第9位點高甲基化，在L組第2、3、4位點高甲基化;Myogenin第一外顯子區(qū)甲基化情況在三組之間沒有明顯不

7、同。葉酸可能正是通過影響基因啟動子區(qū)CpG位點甲基化情況而影響MyoD和Myogenin的表達。
　　我們進一步利用MeDIP-chip技術(shù)檢測了葉酸對C2C12分化過程中全基因組甲基化的影響。結(jié)果表明每兩組之間啟動子區(qū)和CpG島區(qū)都存在大量差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）。啟動子區(qū)的DMRs又根據(jù)CpG含量分為HCP、ICP及LCP，在各組之間DMRs主要是HCP;各

8、組之間CpG島中的DMRs主要位于啟動子區(qū)CpG島中。在NvsL之間啟動子區(qū)共有180 DMRs(84 hypermethylatedand96 hypomethylated)，在HvsL之間共有199 DMRs(95 hypermethylated and104hypomethylated)，在HvsN之間共有201 DMRs(104 hypermethylated and97hypomethylated)。在甲基化譜中NvsL與Hv

9、sL存在較多的common DMRs;而無論是甲基化上調(diào)還是甲基化下調(diào)的DMRs比較，Nvs L與HvsL之間common DMRs均較少。對DMRs所在基因進行功能分析表明NvsL的DMRs主要富集于細胞分化及發(fā)育過程，而Hvs L的DMRs更多富集于細胞周期及各種細胞代謝過程。說明從葉酸缺乏狀態(tài)補充到正常葉酸濃度狀態(tài)，與從正常葉酸濃度補充到高濃度葉酸狀態(tài)是通過調(diào)控不同基因甲基化狀態(tài)及不同的生物學過程而影響C2C12的分化。對甲基化譜

10、及表達譜關(guān)聯(lián)分析表明，DMRs與DEGs之間存在一些關(guān)聯(lián)基因，也就是說在C2C12分化過程中，不同濃度葉酸對基因啟動子區(qū)甲基化的影響可能是一些基因差異表達的直接原因;另一方面，我們可以看出兩組之間的DMRs并不是DEGs的唯一原因，即在不同濃度葉酸條件下引起的基因差異表達是各種調(diào)控綜合作用的結(jié)果。
　　總之，本研究結(jié)果顯示孕期葉酸缺乏能夠改變仔豬背最長肌的基因表達從而影響仔豬骨骼肌的形成，并且母豬葉酸缺乏能夠影響仔豬的脂肪沉積。另