母豬低蛋白日糧通過myostatin通路影響斷奶仔豬骨骼肌生長的機制.pdf

1、母體營養(yǎng)對子代骨骼肌影響的研究已有很多，迄今研究主要集中在妊娠和/或哺乳期間母體限飼或低蛋白日糧對子代肌纖維生長發(fā)育、肌纖維分型及肌纖維蛋白代謝的影響等方面。近年來的研究表明，妊娠期和哺乳期母體飼喂低蛋白日糧可以影響血液胰島素和氨基酸水平，以及肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）通路。然而，母體低蛋白是否影響仔豬骨骼肌肉發(fā)生、肌細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)還不是很清楚。有研究顯示，母體低蛋白日糧可以影響MSTN在骨骼肌中的表

2、達(dá)。本實驗主要研究母豬在兩個時期（妊娠期和哺乳期）飼喂低蛋白日糧是否對其斷奶仔豬血液中氨基酸、尿素氮、總蛋白和胰島素等激素含量產(chǎn)生影響，是否對骨骼肌發(fā)生、肌細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生影響，并通過何種機制調(diào)控MSTN的表達(dá)。
　　1母體日糧蛋白水平對斷奶仔豬表觀指標(biāo)以及生長相關(guān)基因的影響
　　本實驗選用二胎二元長大雜交母豬共16頭。將實驗動物隨機分為標(biāo)準(zhǔn)蛋白(SP)組和低蛋白(LP)組。在妊娠和哺乳期給母豬飼喂含粗蛋白不同

3、但能量相同的飼料。在妊娠期，標(biāo)準(zhǔn)蛋白組飼喂粗蛋白含量為15％的日糧，低蛋白組飼喂粗蛋白為7.5％的日糧。在哺乳期，SP組飼喂粗蛋白含量為18％的日糧，LP組喂粗蛋白含量為9％的日糧。分娩之后，為避免實驗以外其他因素的影響，將每窩仔豬都調(diào)整為7～8只。在分娩28 d后，對仔豬進(jìn)行斷奶，每窩豬中選取一只雄性仔豬進(jìn)行樣品采集。采樣前稱量仔豬的體重。檢測血清中游離氨基酸、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素、皮質(zhì)醇、尿素氮和總蛋白水平;檢測背最長

4、肌RNA、DNA、蛋白的濃度和含量。結(jié)果顯示:斷奶仔豬低蛋白組的體重、背最長肌肌肉重、肌肉蛋白含量以及血液氨基酸、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素、皮質(zhì)醇含量與標(biāo)準(zhǔn)蛋白組相比均無顯著差異，但LP組的斷奶仔豬血清中尿素氮水平和總蛋白水平顯著降低(P＜0.05);LP組仔豬，背最長肌中RNA濃度、RNA含量和蛋白濃度顯著低于標(biāo)準(zhǔn)蛋白組（P＜0.05），DNA含量有降低趨勢(P＜0.1)。母豬飼喂低蛋白日糧影響了其仔豬血清中尿素氮、總蛋白含

5、量以及背最長肌核酸含量，提示，母豬低蛋白日糧可能對子代機體代謝和骨骼肌細(xì)胞生長產(chǎn)生影響。
　　為了探討母體低蛋白日糧影響子代骨骼肌生長發(fā)育的分子機制，用Real-timePCR檢測了肌肉肌肉生長(IGFs、mTOR)、增殖(PCNA、CCND2)、凋亡(Bcl、Bax)和蛋白水解（Atrogin1、MuRF1）等基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)，LP組斷奶仔豬骨骼肌中IGF2R的基因表達(dá)有升高趨勢(P＜0.1)，增殖相關(guān)基因CCND2的基因表達(dá)有

6、降低趨勢(P＜0.1)，但對其余生長、增殖、凋亡以及蛋白降解相關(guān)基因的表達(dá)無顯著影響。這個結(jié)果說明，母體低蛋白日糧可能不直接通過影響子代骨骼肌中這些基因的表達(dá)影響骨骼肌的生長。
　　2母豬低蛋白日糧對仔豬背最長肌MSTN通路的影響及調(diào)控機制
　　運用Real-time PCR檢測了肌肉發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)一步檢測了肌肉發(fā)生相關(guān)基因（MSTN、MyoD、Myf5、Myf6、MEF2和Myogenin）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)母體低蛋白日糧除

7、了顯著升高M(jìn)STN基因表達(dá)之外并沒有影響其余肌肉發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)。于是又檢測了MSTN的兩個受體ACVR2B和ALK5的基因表達(dá)，同時運用Westernblotting方法檢測了MSTN下游信號通路上的ERK、p38-MAPK和JNK的磷酸化蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LP組仔豬背最長肌中ACVR2B和ALK5的基因表達(dá)并無顯著變化，但p38-MAPK磷酸化水平顯著升高(P＜0.05)。提示，母體低蛋白可能通過MSTN及其下游p38-MAPK

8、通路影響子代骨骼肌生長。此外，為了探討MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，運用Real-time PCR和Western blotting的方法檢測了轉(zhuǎn)錄因子(FoxO3、FoxO4、GR和PGC1α)的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低蛋白組斷奶仔豬骨骼肌中FoxO4的基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，F(xiàn)oxO3和GR的基因表達(dá)有升高趨勢(P＜0.1)，PGC1α的基因表達(dá)無顯著變化。Western blotting的方法檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3的蛋白表達(dá)顯著升高(

9、P＜0.05)，其余轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)無顯著變化。為了探討FoxO3和GR是否參與MSTN的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，采用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）的方法檢測FoxO3和GR與MSTN啟動子區(qū)的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LP斷奶仔豬骨骼肌GR與MSTN啟動子區(qū)的一個預(yù)測結(jié)合位點的結(jié)合顯著升高(P＜0.05)，另一個預(yù)測結(jié)合位點的結(jié)合有升高趨勢(P＜0.1)。此外，LP組斷奶仔豬骨骼肌FoxO3與MSTN啟動子的預(yù)測結(jié)合位點結(jié)合顯著升高(P＜0.05)。以