mTORC1在金黃色葡萄球菌及其肽聚糖誘導炎性反應(yīng)中的作用與機制.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種典型的革蘭氏陽性細菌，作為一種環(huán)境致病菌可引起群體感染。金黃色葡萄球菌可引起奶牛乳腺炎，造成奶牛產(chǎn)奶量下降，導致養(yǎng)殖業(yè)嚴重的經(jīng)濟損失。肽聚糖是金黃色葡萄球菌細胞壁的主要成分，作為一種重要的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，是模式識別受體Toll樣受體2(toll like receptor2，TLR

2、2)的配體。肽聚糖與TLR2結(jié)合，導致TLR2胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合并激活MyD88(myeloid differentiation88)，進而募集IRAK(IL-1-receptor kinase)和TRAF6(TNF-receptor-associatedfactor6)，激活NF-κB(transcription factor nuclear factor，NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，誘導炎性因子表達，引起炎癥反應(yīng)。
　　mTOR

3、（mammalian target of rapamycin）是進化上十分保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PIKK(phosphatidyl-inositol3-kinase-related kinase)超家族，在細胞內(nèi)與其它蛋白組成mTORC1(mTOR complex1)和mTORC2(mTOR complex2)兩種復合體。其中mTORC1對rapamycin敏感，在天然免疫反應(yīng)中具有重要作用，但mTORC1是否調(diào)控金黃色葡萄球菌

4、及其肽聚糖誘導的炎性反應(yīng)目前還不清楚。本研究選擇小鼠巨噬細胞和牛乳腺上皮細胞為研究對象，首先以金黃色葡萄球菌肽聚糖作為病原相關(guān)分子模式配體作用于小鼠巨噬細胞，探討mTORC1在調(diào)控肽聚糖誘導炎性因子的表達及巨噬細胞增殖中的作用;進而以金黃色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮細胞，通過比較蛋白質(zhì)組學研究篩選出與細菌侵染相關(guān)的蛋白分子和信號轉(zhuǎn)導通路，并探討mTORC1在這一過程中的調(diào)控作用。旨在將病原相關(guān)分子模式（肽聚糖）和病原體侵染（金黃色葡萄球菌）

5、在誘導炎性反應(yīng)中的作用相互參照，以證明mTORC1在調(diào)控金黃色葡萄球菌及其肽聚糖誘導的炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵性作用及機制。
　　本論文由兩部分組成:第一部分以金黃色葡萄球菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)刺激小鼠巨噬細胞Ana-1，觀察肽聚糖對Ana-1細胞增殖的作用，檢測肽聚糖誘導Ana-1細胞分泌炎性因子（TNF-α，IL-6和IL-10）情況，以證明肽聚糖具有誘導小鼠巨噬細胞分泌炎性因子的作用。同時使用mTORC1特

6、異性抑制劑rapamycin處理細胞，檢測mTORC1信號通路被抑制后肽聚糖誘導Ana-1細胞分泌炎性因子的變化情況，以證明mTORC1對肽聚糖誘導小鼠巨噬細胞分泌炎性因子具有調(diào)控作用。結(jié)果表明:(1)肽聚糖刺激巨噬細胞表達TNF-α，IL-6和IL-10，且具有時間和劑量依賴性。刺激Ana-1細胞最佳濃度和時間分別為25μg/ml/6 hr;(2)使用rapamycin處理細胞抑制mTORC1活性后，肽聚糖誘導的細胞增殖和炎癥因子TN

7、F-α，IL-6分泌減弱，而抑炎因子IL-10分泌增強。說明mTORC1在調(diào)控肽聚糖誘導的炎性因子分泌中，對炎癥因子TNF-α，IL-6和抑炎因子IL-10可能具有不同的調(diào)控機制。
　　為探討mTORC1調(diào)控肽聚糖誘導的巨噬細胞炎性因子表達的分子機制，我們對mTOR信號通路和炎性因子基因表達相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子展開研究。首先利用肽聚糖刺激巨噬細胞，檢測mTOR，S6，4E-BP1蛋白磷酸化水平，觀察肽聚糖是否激活mTOR信號通路;其次，分

8、別采用TLR1和TLR2抗體封閉TLR1和TLR2，抑制其作為肽聚糖受體的功能，檢測細胞因子表達變化及mTORC1信號通路變化;最后，在轉(zhuǎn)錄因子層面上檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT3活性變化情況。結(jié)果表明:(1)肽聚糖激活mTORC1信號通路，rapamycin處理后，肽聚糖誘導的mTOR及其下游效應(yīng)蛋白S6，4E-BP1的磷酸化活性被抑制;(2)采用抗體封閉TLR1和TLR2后，肽聚糖激活的mTORC1信號通路和轉(zhuǎn)錄因子STAT3，

9、NF-κB活性降低，表明TLR1和TLR2介導肽聚糖誘導的mTORC1信號通路激活和轉(zhuǎn)錄因子活化;(3)抗體封閉TLR1和TLR2后，TNF-α，IL-6和IL-10的分泌均減少，表明TLR1和TLR2介導了肽聚糖誘導的炎性因子TNF-α，IL-6和抑炎因子IL-10的表達。
　　通過第一部分的實驗我們可以得到:金黃色葡萄球菌的肽聚糖通過結(jié)合受體TLR1和TLR2，激活mTORC1信號通路和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT3，進而調(diào)控

10、炎癥因子TNF-α，IL-6和抑炎因子IL-10的分泌。mTORC1在這一過程中可能通過不同的機制調(diào)控炎癥因子和抑炎因子的表達。
　　本論文的第二部分以牛乳腺上皮細胞為研究對象，用金黃色葡萄球菌侵染細胞。實驗設(shè)非處理組，金黃色葡萄球菌侵染組，rapamycin處理組，rapamycin處理后金黃色葡萄球菌侵染組等4組，試圖通過比較各組之間的差異表達蛋白篩選出與金黃色葡萄球菌侵染相關(guān)并受mTORC1調(diào)控的炎性反應(yīng)相關(guān)的細胞因子和信號

11、通路。采用iTRAQ技術(shù)獲得了4個組的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù)的兩兩比對獲得了4個比較蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)及其GO功能分析數(shù)據(jù)和KEGG pathway功能分析數(shù)據(jù)。從4組樣品中共鑒定出蛋白1761個;篩選出與mTORC1相關(guān)的差異表達蛋白54個，對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白22個進行了功能注釋;與細菌侵染相關(guān)的差異表達蛋白44個，對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白16個進行了功能注釋;與細菌侵染并與mTORC1相關(guān)的差異表達蛋

12、白61個，對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白27個進行了功能注釋;與細菌侵染相關(guān)并受到mTORC1調(diào)控的差異表達蛋白58個，對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白22個進行了功能注釋。
　　綜上所述，mTORC1信號通路在調(diào)控肽聚糖誘導的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其可能的分子機制為肽聚糖通過TLR1和TLR2激活mTORC1通路，進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT3，調(diào)控炎性因子表達。蛋白質(zhì)組學研究表明，mTORC1可能在金黃