瘦肉型豬（PIC344）精液酸性磷酸酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、從瘦肉型豬(PIC344)精液中分離提純到酸性磷酸酶(ACPase,E.C.3.1.3.2),并對其生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究.首先用紗網(wǎng)從新鮮精液中濾掉膠狀物得到原精液,該原精液經(jīng)反復(fù)凍融、分段鹽析、DEAE-Sepharose F.F離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠過濾等純化步驟,用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)為單一蛋白區(qū)帶的酶制劑.提純倍數(shù)為22.78,酶液比活力為15.26U/mg蛋白(對硝基苯磷酸二鈉作底物).用動力學(xué)方

2、法測得該酶最適pH為3.6,最適溫度為52℃.ACPase在pH4.5~6.0范圍內(nèi)穩(wěn)定,在40℃以下酶活穩(wěn)定,50℃保溫30min后酶活仍能保持59.2﹪.以對硝基苯磷酸二鈉作底物測得Km值為3.8×10<'-3>mol/L.利用SDS-PAGE測定酶的相對分子質(zhì)量為52.3kDa.等電聚焦測得酶的等電點(diǎn)為5.11.選擇K<'+>、Mg<'2+>、Ni<'2+>、Zn<'2+>、Mn<'2+>、Fe<'2+>、Cd<'2+>、Ca<'

3、2+>、Cu<'2+>九種金屬離子以及EDTA和脲作用于ACPase,發(fā)現(xiàn)K<'+>、Mg<'2+>、Ca<'2+>、Ni<'2+>、Mn<'2+>對ACPase有不同程度的激活作用.Cu<'2+>、Cd<'2+>、Fe<'2+>、Zn<'2+>對ACPase有不同程度的抑制作用.同一濃度范圍內(nèi)的金屬離子對ACPase的激活強(qiáng)弱依次為Mg<'2+>>Ni<'2+>>Mn<'2+>>K<'+>>Ca<'2+>,對ACPase的抑制強(qiáng)弱依次

4、為Cu<'2+>>Cd<'2+>>Fe<'2+>>Zn<'2+>.蛋白變性劑脲能使酶失活.利用雙倒數(shù)作圖法研究Cu<'2+>、Cd<'2+>對酶的作用,結(jié)果表明這兩種抑制劑對酶的抑制作用為非競爭性抑制,用Dixon作圖法求抑制常數(shù)Ki值分別為0.58×10<'-3>mmol/L、9.44×10<'-3>mmol/L.研究Mg<'2+>、Ca<'2+>、Cd<'2+>、Cu<'2+>對酶熒光光譜的影響,結(jié)果表明:Mg<'2+>、Ca<'2

5、+>引起酶熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度降低,最大發(fā)射波長不變.Cd<'2+>、Cu<'2+>引起酶熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度降低,最大發(fā)射波長不變,說明這些金屬離子對酶的構(gòu)象有不同程度的影響..研究化學(xué)修飾劑二巰基蘇糖醇(DTT)、對氯汞苯甲酸(pCMB)、N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、溴代乙酸(BrAc)在不同濃度,不同時間條件下對酶活力的影響.結(jié)果表明:不同濃度化學(xué)修飾劑DTT、pCMB、NBS、PMSF的修飾能抑制ACPase