含NDVF基因的MDV CV1988株轉移質粒載體的構建及表達.pdf

1、新城疫是由新城疫病毒引起的雞和火雞的一種急性高度接觸性傳染病.20世紀40年代就開始使用新城疫疫苗,通常使用的疫苗為活病毒苗.但活疫苗會導致雞群產(chǎn)生輕微呼吸道癥狀,從而繼發(fā)細菌感染.這些疫苗產(chǎn)生的免疫反應持續(xù)時間短,必須進行多次免疫接種;且雛雞具有較高的母源抗體,會干擾疫苗的免疫效果.因此,構建重組病毒來表達與新城疫病毒免疫有關的抗原基因,試圖解決以上問題.馬立克氏病是由馬立克氏病病毒引起的雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤病.馬立克氏病病毒

2、疫苗株被認為是最有潛力的病毒載體之一,通過構建表達外源基因抗原的多價活疫苗來誘導免疫達到預防禽病的目的.考慮多價重組疫苗的諸多優(yōu)點,該試驗利用馬立克氏病病毒的gB啟動子控制新城疫病毒F基因的表達來構建重組馬立克氏病病毒,使其能有效地預防新城疫和由馬立克氏病病毒超強毒株引起的馬立克氏病,且既可以避免病毒對外源啟動子的排斥作用,又可以避免母源抗體的影響來提高疫苗對商品雞的免疫保護作用.根據(jù)GenBank己發(fā)表的新城疫病毒F48E9株F基因序

3、列,設計了一對引物,以含有新城疫病毒F48E9株F基因的質粒pzl/z2為模板,將擴增的F基因(1 678bp)片段克隆到真核表達載體pIRES中,構建成表達F基因的載體pIRESF.再根據(jù)GenBank己發(fā)表的載體pIRES基因序列,設計了一對引物,以載體pIRESF為模板將擴增的包含F(xiàn)基因及其上游的內含子和下游的polyA的2 900bpDNA片段,再克隆入包含馬立克氏病病毒的gB啟動子的pBluescript Ⅱ SK載體中,并使

4、其克隆到gB啟動子580bp的下游,最后將包含gB啟動子和F基因表達盒3 500bp克隆到馬立克氏病病毒CVI988非必需區(qū)US10基因中,并命名為pUS10F.在試驗中,我們選擇CVI988疫苗株作為病毒載體來構建重組病毒,原因是致弱的MDVI型疫苗如CVI988,它們的免疫效果明顯優(yōu)于HVT,同時疫苗株MDVI型與vvMDV的抗原有較高的同源性,理論上可以比其他血清型更能誘導具有針對性的免疫應答反應,特別是針對vvMDV和vv+MD

5、V.為進一步提高重組病毒的表達水平,將成功構建的轉移質粒載體轉染293T細胞后,對轉染條件進行了優(yōu)化,通過利用轉染后293T細胞的基因組作為模板進行PCR,結果說明真核細胞中已有帶F基因的細胞存在,質粒載體已經(jīng)進入細胞DNA.間接免疫熒光檢測結果表明,轉染質粒載體后的293T細胞可特異性地表達NDV的F基因,所表達基因的抗原性較好,能夠與抗DNV的標準血清反應.從而說明轉移質粒載體中的基因表達盒可以在細胞中有效地表達,為進一步開發(fā)新型的