豬瘟兔化弱毒（C株）和雞馬立克火雞皰疹病毒（HVT）病毒保護(hù)劑的研究.pdf

1、第一部分 豬瘟兔化弱毒(C株)病毒保護(hù)劑的研究該試驗將6種病毒保護(hù)劑基質(zhì)運用于PK15細(xì)胞,雞胚成纖維細(xì)胞,帶毒牛睪丸細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)實時觀察法篩選出一種病毒保護(hù)劑Ⅰ,并確定其工作濃度為10％.通過建立PK15細(xì)胞、豬瘟Thiveosal株及病毒保護(hù)劑三者相互關(guān)系模型,為提高豬瘟細(xì)胞疫苗的效價構(gòu)建理論規(guī)律.首先,我們運用常規(guī)細(xì)胞實時計數(shù)法,建立PK15細(xì)胞增殖曲線和帶毒PK15細(xì)胞的增殖曲線,發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒對PK15細(xì)胞不但不產(chǎn)生細(xì)胞

2、病變,反而促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖,在48小時細(xì)胞生長的對數(shù)期,帶毒的PK15細(xì)胞的分裂增殖數(shù)是未帶毒細(xì)胞的131.5％.運用直接免疫熒光法篩選出最佳細(xì)胞密度、最佳接毒量及最佳接毒方式的產(chǎn)毒模型.建立了常規(guī)對照組(未加病毒保護(hù)劑)的病毒增殖曲線和加入病毒保護(hù)劑的病毒增殖曲線,從兩者對比結(jié)果看,直接免疫熒光檢測病毒保護(hù)劑增殖病毒的結(jié)果并不明顯,但相同滴度下加入病毒保護(hù)劑組測得熒光斑較亮且致密.進(jìn)一步運用活細(xì)胞染色排除法證明病毒保護(hù)劑具有提高帶毒

3、細(xì)胞數(shù)量的功能.同樣原始的細(xì)胞經(jīng)過60h后,試驗組的帶毒活細(xì)胞數(shù)是對照組的1.22倍,而活細(xì)胞比率基本一致.運用MTT活力測定同樣驗證了試驗組活細(xì)胞增幅優(yōu)于對照組.生產(chǎn)應(yīng)用中提取的樣品病毒蛋白濃度測定表明試驗組的病毒濃度比對照組提高22％.病毒保護(hù)劑運用于豬瘟兔化弱毒牛睪丸細(xì)胞毒疫苗生產(chǎn)中,發(fā)現(xiàn)20％的病毒保護(hù)劑對產(chǎn)毒有輕微損傷作用,10％的病毒保護(hù)劑測毒的兔體熱型反應(yīng)統(tǒng)計數(shù)是對照組的兩倍.試驗組和對照組的反復(fù)凍融試驗表明對照組反復(fù)凍融

4、6次即為臨界點,超過6次即達(dá)不到配苗的要求,而加入病毒保護(hù)劑后反復(fù)凍融10次,也能達(dá)到配苗的要求.冷凍保存期試驗表明對照組保存3月合格,而病毒保護(hù)劑組可保存到5個月合格.37℃熱試驗表明對照組置37℃8小時合格,而病毒保護(hù)劑組置37℃10小時達(dá)到合格.通過細(xì)胞毒電鏡觀察及主要保護(hù)性抗原基因E2、E0測序比對結(jié)果表明:病毒保護(hù)劑不影響病毒粒子形態(tài)的變化,且不產(chǎn)生基因突變.抗體水平檢測和免疫攻毒試驗結(jié)果表明:病毒保護(hù)劑能刺激機(jī)體早期中和抗體

5、的產(chǎn)生,且免疫保護(hù)力堅強(qiáng).第二部分 雞馬立克氏病火雞皰疹病毒(HVT)病毒保護(hù)劑的研究該試驗配制兩種不同的病毒保劑A和B,應(yīng)用于HVT活疫苗生產(chǎn)中,進(jìn)行3批試驗,結(jié)果表明:B蝕斑數(shù)比對照平均增加121％,A至少減少14％,說明病毒保護(hù)劑B具有一定的促進(jìn)病毒增殖的功能.病毒保護(hù)劑B進(jìn)行最佳添加濃度篩選試驗結(jié)果表明合適的添加濃度:1次細(xì)胞為1％或2％,2次細(xì)胞工作濃度為2％.病毒保護(hù)劑B擴(kuò)大中試試驗,進(jìn)行3批,結(jié)果表明:裂前1萬倍稀釋,保護(hù)

6、劑組比對照組蝕斑數(shù)平均增幅達(dá)143％;裂后4萬倍稀釋,保護(hù)劑組比對照組蝕斑數(shù)增幅平均可達(dá)66.5％.馬立克HVT活疫苗(病毒保護(hù)劑)特異性試驗表明,馬立克標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的HVT活疫苗(含保護(hù)劑B)特異性識別,含有病毒保護(hù)劑不改變HVT的抗原性.馬立克HVT活疫苗(病毒保護(hù)劑B)和常規(guī)對照苗耐熱對比試驗結(jié)果表明:平行凍干一批疫苗,批號為:200401,試驗組比對照組蝕斑數(shù)高200％;經(jīng)37℃10天耐熱試驗,試驗組比對照組蝕斑數(shù)高242％.試