豬溫兔化弱毒標(biāo)記株感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救.pdf

1、豬瘟(Classic Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classic Swine Fever virus,CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染疾病,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International des Epizoofies,OIE)列為必須通報(bào)傳染病之一。豬瘟的流行給世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和貿(mào)易造成了巨大損失。豬瘟兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized vurus.HCLV)從1957年就在國(guó)

2、內(nèi)廣泛應(yīng)用于豬瘟的預(yù)防(Zhou TC,1980)。不僅為我國(guó),而且還為歐洲國(guó)家CSF控制作出了重大貢獻(xiàn),是世界公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)弱毒疫苗。但由于疫苗接種豬與自然感染豬不能從血清學(xué)上予以區(qū)分,不利于豬瘟的凈化和消滅,研制標(biāo)記疫苗有助于解決這個(gè)問(wèn)題。
　　 本研究運(yùn)用反向遺傳操作技術(shù),在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的C株感染性克隆的基礎(chǔ)上,在E1的C末端插入FLAG基因作為標(biāo)記分子,構(gòu)建含有FLAG基因的豬瘟兔化弱毒標(biāo)記毒株vC-FLAG的感染性克隆,

3、并成功拯救出含有FLAG標(biāo)記的vC-FLAG病毒,并采用豬瘟E2單克隆抗體WH303,FLAG單克隆抗體免疫組化染色,RT-PCR、熒光定量PCR等方法鑒定拯救病毒為vC-FLAG病毒。通過(guò)病毒的細(xì)胞適應(yīng)性實(shí)驗(yàn),證明vC-FLAG病毒可以適應(yīng)多種豬源細(xì)胞,其中以SK6細(xì)胞為最佳。通過(guò)常規(guī)病毒傳代、細(xì)胞帶毒傳代以及帶毒細(xì)胞混合正常細(xì)胞培養(yǎng)等方法研究標(biāo)記病毒的傳代方式,使用豬瘟病毒抗原檢測(cè)ELISA以及傳代病毒滴度測(cè)定,探索病毒增殖的最佳條

4、件。證明了SK6細(xì)胞系是培養(yǎng)vC-FLAG的最適細(xì)胞系,探索出了使用帶毒細(xì)胞混合正常細(xì)胞進(jìn)行傳毒的病毒傳代方法。不同代次病毒經(jīng)免疫組化、RT-PCR和核苷酸序列測(cè)定證明嵌合病毒能穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)記抗原,且在細(xì)胞中傳代的遺傳穩(wěn)定性良好。
　　 通過(guò)兔體實(shí)驗(yàn),研究了豬瘟兔化弱毒標(biāo)記毒株與兔體反應(yīng)熱的關(guān)系,以及兔豬瘟抗體的消長(zhǎng)情況。vC-FLAG保持了與C株兔組織毒一樣的能夠引起典型的兔體反應(yīng)熱的特性。并且兩株病毒引起的兔血清豬瘟抗體增長(zhǎng)規(guī)

5、律一致。vC-FLAG在兔體上連續(xù)傳四代,經(jīng)RT-PCR測(cè)序證明該毒株在兔體上的遺傳穩(wěn)定性良好。
　　 為探索研究FLAG抗體的檢測(cè)方法,分別采用FLAG的合成肽,FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反應(yīng)板,首先使用FLAG單克隆抗體建立間接ELISA檢測(cè)方法。比較發(fā)現(xiàn)FLAG-BAP蛋白包被的ELISA反應(yīng)板更加靈敏。于是采用FLAG-BAP包被ELISA反應(yīng)板進(jìn)行兔血清抗體的檢測(cè),在接種vC-FLAG和C株第21天的兔血清

6、中FLAG抗體水平并沒(méi)有太大的差別。隨后使用商品化兔抗FLAG多克隆抗體進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)于檢測(cè)兔抗FLAG抗體并沒(méi)有明顯的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,標(biāo)記抗體檢測(cè)方法尚不成熟,但為進(jìn)一步研究標(biāo)記抗體檢測(cè)方法提供了重要數(shù)據(jù)。
　　 綜合上述結(jié)果表明,vC-FLAG標(biāo)記嵌合毒株,可以很好的展示FLAG抗原肽,并且可采取感染細(xì)胞混合正常細(xì)胞培養(yǎng)的方式進(jìn)行大量繁殖,在細(xì)胞和兔體上傳代遺傳穩(wěn)定。vC-FLAG保持著C株在兔體上引起典型兔體