鵝圓環(huán)病毒感染性克隆的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染試驗(yàn).pdf

1、鵝圓環(huán)病毒(goose circovirus, GoCV)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒科的一個(gè)新成員。由于它通常侵染淋巴細(xì)胞等增殖速度快的細(xì)胞,引起免疫力下降,導(dǎo)致動(dòng)物容易繼發(fā)感染其他病原,從而給養(yǎng)禽業(yè)造成不可忽視的經(jīng)濟(jì)損失。2005年,我們實(shí)驗(yàn)室從永康禽流感病死鵝中檢測(cè)到了GoCV,并構(gòu)建了含有GoCV1813 bp近全長(zhǎng)基因組的pMDT-GoCV-yk01質(zhì)粒。以該質(zhì)粒DNA為模板,應(yīng)用設(shè)計(jì)帶BamH I酶切標(biāo)記位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增獲得

2、GoCV1821 bp帶標(biāo)記的全長(zhǎng)基因組DNA,克隆到pGEM-T Easy載體上,經(jīng)酶切鑒定得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGEMT-GoCV-Bam。BamHⅠ酶切該重組質(zhì)粒,割膠回收1.8 kb的GoCV全長(zhǎng)基因組DNA片段,自連后再與接頭連接,以接頭為引物PCR擴(kuò)增,并經(jīng)割膠回收獲得雙拷貝GoCV全長(zhǎng)基因組的3.6 kb DNA片段,克隆于pGEM-T Easy,經(jīng)酶切鑒定,篩選到含GoCV全長(zhǎng)基因組正向串聯(lián)二聚體的克隆pGEMT-2GoCV

3、。EcoR I酶切pGEMT-2GoCV質(zhì)粒并進(jìn)行純化與濃縮,獲得感染性克隆DNA樣品。脂質(zhì)體包裹處理好的感染性克隆DNA,分別經(jīng)尿囊腔和胚體接種GoCV陰性的鵝胚、經(jīng)腹腔和靜脈接種雛鵝,經(jīng)常規(guī)PCR方法檢測(cè)到GoCV在體內(nèi)的增殖。將已發(fā)表的24株鵝圓環(huán)病毒全長(zhǎng)基因組序列進(jìn)行聯(lián)配,找出其保守序列區(qū)域,利用軟件Primer Premier 5.0重新設(shè)計(jì)合成3對(duì)引物,用常規(guī)PCR方法篩選出其中的一對(duì)。以構(gòu)建的pMDT-GoCV-yk01,

4、質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板,經(jīng)退火溫度、循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了GoCV熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)溶解曲線分析確定了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。試驗(yàn)結(jié)果表明,建立的GoCV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)范圍廣,Ct值范圍為12～32,最低檢出拷貝數(shù)為1.46×102。應(yīng)用建立的方法對(duì)常規(guī)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)染樣品進(jìn)行了定量,結(jié)果陽(yáng)性法氏囊樣品中GoCV DNA含量為1.57x106拷貝/mg,6個(gè)陽(yáng)性血清中的含量為4.96×104～5.92x105拷貝/