14646.串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序技術(shù)體系的建立、應(yīng)用及無指盤臭蛙皮膚先天免疫的時空動態(tài)

1、By【Liu，Jiongyu】ADissertation／ThesisSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfdlmentoftherequirementForthedegreeofDoctorof【Science】[ChengduInstituteofBiology，ChineseAcademyofSciences】May，2013摘要摘要普遍認為兩

2、棲動物皮膚功能基因組具有多態(tài)性豐富、隨環(huán)境變化而快速重組突變的特征，造成這種分子多態(tài)性和復(fù)雜性的顯著差異的因素，最合理的解釋就是環(huán)境，尤其是環(huán)境微生物的驅(qū)動，然而此理論還缺乏足夠的研究證據(jù)。已有研究表明，不同產(chǎn)地或不同時間點的無指盤臭蛙皮膚抗菌肽種類和數(shù)量多變，而抗菌肽為兩棲動物先天免疫系統(tǒng)的主要成分，也是皮膚分泌物中的主要多肽。因此，研究無指盤臭蛙皮膚的先天免疫(首先是分泌物，然后是抗菌肽)的動態(tài)變化及與環(huán)境因子，特別是環(huán)境細菌的關(guān)系

3、，有可能解決兩棲動物皮膚功能基因組受環(huán)境，尤其環(huán)境細菌驅(qū)動的問題。本論文首先以景東臭蛙為對象，分離純化皮膚抗菌肽并鑒定一級結(jié)構(gòu)，從而建立以串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序技術(shù)為核心的兩棲動物皮膚分泌活性多肽的研究技術(shù)體系，克服兩棲動物皮膚功能基因組受環(huán)境驅(qū)動問題的研究在抗菌肽層次的主要技術(shù)瓶頸；然后以無指盤臭蛙為研究對象，從分泌物的層次研究了不同地點或同一地點不同時間點的動物先天免疫的動態(tài)變化；最后利用建立的技術(shù)體系進行了無指盤臭蛙皮膚分泌物中動態(tài)變化

4、抗菌肽的初步研究。(A)景東臭蛙皮膚抗菌肽的分離純化、鑒定及活性研究以景東臭蛙為對象，分離純化皮膚抗菌肽、鑒定序列并驗證活性，研究結(jié)果：1發(fā)現(xiàn)了8個抗菌肽，其中兩對具有相同的理論分子量且難于被HPLC分離。2Brevinin1JDa和Nigrocin2JDa為首次在天然蛋白水平被確認，Brevinin1JDc為新肽，且二硫環(huán)內(nèi)序列CLISKKC為首次在抗菌肽中被發(fā)現(xiàn)。3在4個抗菌肽的二級質(zhì)譜中觀察到了罕見的低能量、陽離子模式下的分子內(nèi)二

5、硫環(huán)內(nèi)斷裂現(xiàn)象，且首次闡明了其完整裂解途徑為：C端肽鍵按照環(huán)肽斷裂模式依次斷裂，然后在C—S鍵上發(fā)生次級剪切，此類斷裂的標志離子為[MH一28】；此發(fā)現(xiàn)說明二硫環(huán)內(nèi)斷裂現(xiàn)象在含C端二硫環(huán)的肽中可能并不罕見，此機理的提出為Topdown測序直接鑒別二硫環(huán)內(nèi)序列提供了可能，也能被用于二硫鍵定位。4殺菌動力學(xué)研究結(jié)果揭示了發(fā)現(xiàn)的部分抗菌肽，其作用機理可能不同于經(jīng)典的膜破壞機理。(B)串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序技術(shù)體系的組成與關(guān)鍵點通過以上實踐研究，建立