無指盤臭蛙和山溪鯢皮膚及卵中3種生物活性多肽的分離鑒定和克隆.pdf

1、兩棲類動物屬于一類可持續(xù)利用的自然資源，它們具有多種多樣的科研及利用價值。此外，它們的組織中含有大量的分子結構特殊、功能復雜多樣的生物活性物質，它們是有待于開發(fā)的資源寶庫。中國擁有豐富的兩棲類動物資源，共有284個種(亞種)，其中2／3是特有種類，它是我國生物資源的重要組成部分，也是人類的寶貴財富，對我國兩棲類動物資源的開發(fā)利用有很大的潛力。目前，已分離鑒定出許多具有各種生物活性的蛋白及多肽。 我們收集分布于中國西南境內的2種常

2、見的藥用、食用兩棲類：山溪鯢(Batrachuperus pachunii)及無指盤臭蛙(Rana grahami)，并對這2種兩棲類皮膚分泌液及其卵進行了如下一系列的生物活性篩選研究：(1)以發(fā)色底物對2種兩棲類動物皮膚分泌液進行絲氨酸蛋白酶水解活性和絲氨酸蛋白酶抑制劑活性測定，山溪鯢皮膚分泌液無絲氨酸蛋白酶水解活性，無指盤臭蛙皮膚分泌液及卵勻漿液顯示較強的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性；(2)2種兩棲類皮膚分泌液具有較強的抗茵活性，而其卵勻

3、漿液則無明顯抗菌作用；(3)2種兩棲類的皮膚分泌液不具備出血活性，無指盤臭蛙卵勻漿液顯示較弱的溶血活性，而山溪鯢卵勻漿液無溶血活性。(4)2種兩棲類皮膚分泌液及其卵勻漿液對正常人血漿的復鈣時間沒有明顯的影響，即它們對正常人血液沒有明顯的促凝和抗凝作用。 進一步通過生物化學，分子生物學手段和研究方法，分別從2種兩棲動物皮膚分泌液或卵勻漿液中，我們得到了3種生物活性多肽類或蛋白類物質， 包括兩個抗菌肽、兩個絲氨酸蛋白酶抑制劑及β-

4、microseminoprotein樣蛋白。并分別對這幾類活性多肽類或蛋白類物質進行了進一步研究。 通過S印hadex G-50凝膠過濾、反相高壓液相等生化技術手段，從無指盤臭蛙皮膚分泌液中得到兩個具有廣譜抗菌活性的抗菌肽。該兩個抗菌肽被命名grahamin 1 andgrahamin 2。Edman降解法測序結果grahaminl的氨基酸序列為GLLSGILGAGKNIVCGLSGLC；grahamin 2的氨基酸序列為GLL

5、SGILGAGKHIVCGLSGLC；快原子轟擊質譜分析表明，grahamin l及grahamin 2的分子量分別為1942Da和1965Da，結果與理論分子量(1942.5Da和1965.6Da)基本相符。grahamin l及grahamin 2氨基酸序列比較分析顯示，兩個抗菌肽只有一個氨基酸殘基的差異，在他們的c-末端包含有蛙屬動物共有的Rana box區(qū)域；他們具有凈電荷、堿性氨基酸數目、疏水性等抗菌肽的典型特征。同源性比較顯

6、示，純化得到的兩個抗菌肽與來源于黑斑蛙皮膚分泌液的nigrocins有66％的同源性；利用測序得到的N-末端氨基酸序列并參照其他蛙類編碼抗菌肽的核苷酸序列設計引物，從無指盤臭蛙皮膚cDNA文庫中克隆及篩選到兩個cDNA序列。由這兩個序列推導的氨基酸序列中包含了分離純化得到的兩個抗菌肽的氨基酸序列。綜合以上信息，grahamin 1及grahamin2屬于包含一個內二硫鍵的單鏈抗菌肽家族。通過分子篩、離子交換層析及反相高壓液相色譜等分離純

7、化程序，從無指盤臭蛙卵的勻漿液中得到了兩個表觀分子量約為40kDa和14.4KDa的單鏈蛋白。它們分別被命名為RGETI-1和RGETI-2。RGETI-1對胰蛋白酶具有專一性的抑制活性，對胰蛋白酶的抑制常數為29.5nM。測得RGETI-1的N-末端部分氨基酸序列為KDRACKLSPDVGPCKAYMQRC。經BLAST搜尋比對，該蛋白與來源于加蓬灣蝮蛇(Bitis gabonica)蛇毒腺液及棕色狗蜱(Rhipicephalus s

8、anguineus)唾液腺的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑分別有57％和87％的同源性，該蛋白的12～15氨基酸殘基位點與典型的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑活性中心完全相同。結合其N-末端氨基酸序列BLAST搜尋結果及性質，推測該蛋白屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。RGETI-2對胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶及彈性蛋白酶具有抑制活性；對這三類酶的抑制常數分別為0.24uM、4.4nM和0.637uM。酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性分析

9、顯示，RGETI-1和RGETI-2在PH2-11及30℃-100℃的條件下，均能保持抑制劑活性，顯示其潛在的應用價值。 從山溪鯢(Batrachuperus pachunii)皮膚勻漿液中經過Sephadex G-50凝膠過濾、AKTA<'〇R> Resource Q陰離子柱和反向高壓液相C<,4>柱，分離純化得到一個表觀分子量為12kDa的小分子蛋白。利用其N-末端氨基酸序列設計引物，從山溪鯢皮膚cDNA中克隆及篩選到該蛋白

10、的cDNA序列。該cDNA序列的開放閱讀框為342bp，編碼113個氨基酸殘基組成的蛋白。經BAST數據庫搜尋比對分析表明，該蛋白的氨基酸序列與來自人類及其他哺乳動物β-microseminoprotein蛋白具有約40％的序列同源性。這也是首次在動物皮膚中確認β-microseminoprotein。初級結構分析表明，該蛋白屬于親水性蛋白；多重序列比較顯示，其氨基酸序列中的10個半胱氨酸位點及15個其他氨基酸位點與高等脊椎動物β-mi