黑帶蛙(Rana nigrovittata)皮膚中膽囊收縮素和緩激肽的分離純化、分子克隆及結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、兩棲類動物屬于一類可持續(xù)利用的自然資源，它們具有藥用、食用、美學(xué)等多種科研及利用價(jià)值，此外，它們的組織中含有大量分子結(jié)構(gòu)特殊、功能復(fù)雜多樣的生物活性物質(zhì)，是有待于開發(fā)的資源寶庫，中國擁有豐富的兩棲類動物資源，共有325個(gè)種(亞種)，其中2/3是特有種類，它是我國生物資源的重要組成部分，也是人類的寶貴財(cái)富，因此我國兩棲類動物資源的開發(fā)利用有很大的潛力.目前，已從兩棲類動物中分離鑒定出許多具有多種生物活性的蛋白及多肽. 通過生物化學(xué)

2、，分子生物學(xué)的手段和研究方法，從兩棲動物黑帶蛙(Rananigrovittata)皮膚分泌液中，我們得到了兩種皮膚生物活性多肽類物質(zhì)，包括一個(gè)膽囊收縮素和一個(gè)緩激肽，并分別對這兩種活性多肽類物質(zhì)進(jìn)行了研究。 通過Sephadex G-50凝膠過濾、反相高壓液相色譜等手段，從黑帶蛙皮膚分泌液中分離到一個(gè)膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)。Edman降解測序結(jié)果顯示：CCK的N-末端氨基酸殘基序列為RVDGNSDQ

3、KAVIGAMLAKDLQTRKAX.BLAST分析結(jié)果表明，該氨基酸殘基序列與從牛蛙(Rana catesbeiana)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)中得到的膽囊收縮素具有顯著的同源性。根據(jù)膽囊收縮素(CCK)的保守性，我們以編碼牛蛙膽囊收縮素(CCK)信號肽起始密碼子開始的21個(gè)堿基設(shè)計(jì)5’特異性引物，從黑帶蛙皮膚cDNA文庫中克隆到了編碼CCK的cDNA全序列。我們首次從兩棲動物皮膚中發(fā)現(xiàn)了膽囊收縮素，并也在皮膚中克隆

4、得到了它的cDNA序列. 通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜得知從黑帶蛙皮膚分離的到膽囊收縮素(CCK)的分子量為6584.07 Da，該分子量與由CCK的cDNA序列推導(dǎo)得到的分子量6502.26 Da多80 Da.已知從牛蛙的大腦、腹腔中分離到的CCKs在氨基酸序列中有一個(gè)酪氨酸殘基硫酸化(Tyr-SO3)位點(diǎn)。當(dāng)酪氨酸殘基硫酸化之后，將導(dǎo)致約80 Da分子量的增加，因此這極有可能是黑帶蛙CCKs在氨基酸殘基序列中Tyr

5、處也發(fā)生了硫酸化(Tyr-SO3)的結(jié)果。 通過分子篩、反相高壓液相色譜等分離純化方法，從黑帶蛙皮膚分泌物中分離得到了一種緩激肽，命名為Ranakinin-N，具有促離體豚鼠回腸肌收縮的活性，并且它對離體豚鼠回腸肌收縮的活性的影響具有濃度依賴性.Edman降解和快原子轟擊質(zhì)譜法分析結(jié)果：氨基酸序列為RAEAVPPGFTPFR，理論分子量為1442.8 Da.Ranakinin-N與從其它兩棲動物分離得到的緩激肽在結(jié)構(gòu)上具有很高的

6、相似性。像其它的緩激肽類似肽一樣，Ranakinin-N也具有PPGF四氨基酸殘基的保守區(qū)域. 將Ranakinin-N的cDNA序列與另一種兩棲動物花臭蛙(Odorrana schmackeri)中編碼緩激肽cDNA的序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)Ranakinin-N的cDNA成熟肽編碼區(qū)少了15個(gè)核苷酸(agaatgatcagacgc)，而這15個(gè)堿基存在于花臭蛙Odorranaschmackeri編碼緩激肽的cDNA序列中