14164.大腸桿菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重組表達(dá)與應(yīng)用研究

1、分類號：UDC：Q78密級：華東理工大學(xué)學(xué)位論文大腸桿菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重組表達(dá)與應(yīng)用研究張廣宇指導(dǎo)教師姓名：歐伶副教授華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)名稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文定稿日期：2013年10月論文答辯日期：2013年10月學(xué)位授予單位：華東理工大學(xué)學(xué)位授予日期：答辯委員會主席：盧艷花教授評閱人：趙健教授王富軍副教授華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁大腸桿菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重組表達(dá)與應(yīng)用研究摘要胸苷激

2、酶(TK)是大腸桿菌胸苷酸補(bǔ)救代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，該酶在M92存在下，可以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作為磷酸基團(tuán)的供體，催化胸苷(TR)磷酸化，生成胸苷酸(TMP)。聚磷酸激酶(PPK)可以多聚磷酸為底物，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至ADP生成ATP。利用聚磷酸激酶的這種特性，將其與大腸桿菌中的胸苷激酶催化的反應(yīng)偶聯(lián)，可有效地形成ATP循環(huán)，將多聚磷酸中的磷酸基團(tuán)以ArP為中介，轉(zhuǎn)移至胸苷，生成胸苷酸。本研究主要是構(gòu)建含胸苷激酶和聚磷酸激酶基

3、因的重組菌株，以此將兩個(gè)反應(yīng)聯(lián)系起來，形成一個(gè)以ATP為中介的能量循環(huán)體系，實(shí)現(xiàn)胸苷酸的不斷生成。將大腸桿菌K12的胸苷激酶基因，蹴和聚磷酸激酶基因即尼，分別克隆到pET28a表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建了重組菌株DTK和DPK，同時(shí)構(gòu)建了串聯(lián)共表達(dá)重組菌株DKK。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，sDs—PAGE分析可得，各重組菌株均可表達(dá)出可溶性酶蛋白，并對各蛋白的酶活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重組菌表達(dá)出的酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌