禽和豬冠狀病毒的檢測(cè)及IBV H52疫苗株的動(dòng)物散毒試驗(yàn).pdf

1、　　本文參考GenBank上登錄的冠狀病毒屬各成員基因序列，根據(jù)其pol基因的一個(gè)共同保守區(qū)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)通用型引物，通過(guò)對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)參考株RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，均得到預(yù)期大小為251bp的核酸片段，從而建立起以該引物為基礎(chǔ)的通用型RT-PCR。用該通用型RT-PCR，分別檢測(cè)禽疑似IBV樣品64份，陽(yáng)性29份；豬疑似TGEV樣品26份，陽(yáng)性5份。對(duì)所檢測(cè)到的陽(yáng)性樣品的RT-PC

2、R產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示所檢測(cè)目的片段與所報(bào)道的IBV或TGEV對(duì)應(yīng)基因片段相符。該引物不擴(kuò)增新城疫病毒、禽流感病毒、豬繁殖呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒等的核酸。表明該通用型RT-PCR能檢測(cè)IBV和TGEV，從而為用該方法檢測(cè)其他冠狀病毒、追蹤和鑒定未知冠狀病毒提供了技術(shù)支持?！　膸в须u傳染性支氣管炎病毒(IBV)pol基因cDNA片段重組質(zhì)粒中擴(kuò)增、回收251bp目的片段，利用隨機(jī)引物標(biāo)記法制備檢測(cè)IBV病毒核酸的地高辛(DIG)標(biāo)

3、記探針。該探針結(jié)合已建立的RT-PCR法，檢測(cè)64份疑似臨床病料，31份陽(yáng)性；而RT～PCR擴(kuò)增結(jié)合核酸測(cè)序確診為陽(yáng)性的只有29份。探針最低能檢出量約3.4pg的IBV反轉(zhuǎn)錄物；與新城疫病毒、傳染性囊病病毒、禽流感病毒、正常雞胚尿囊液、正常雞腎組織等的RT-PCR產(chǎn)物雜交呈陰性。表明利用DIG探針結(jié)合RT-PCR檢測(cè)IBV，敏感性強(qiáng)，可重復(fù)性好，能克服RT-PCR非特異性反應(yīng)和探針Northern雜交的不穩(wěn)定性?！　BVH52疫苗接

4、種1月齡非免疫雛雞，采集其接種后1月內(nèi)咽喉和肛門拭子，用已建立的RT-PCR/DIG方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用9日齡SPF雞胚接種陽(yáng)性樣品，并用RT-PCR法擴(kuò)增接種樣品的雞胚尿囊液RNA。實(shí)驗(yàn)中，咽喉拭子最早檢測(cè)到病毒是接種后第1天，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品有第1-7天、第10天，共8份；肛門拭子最早檢測(cè)到病毒是接種后第4天，陽(yáng)性樣品有第4、6、19、20、25、29、30天，共7份。顯示弱毒疫苗接種雞體后，在1月內(nèi)能持續(xù)向外排毒。因此，IBV