黃芪載入肝素修飾膠原促血管再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：組織工程被認(rèn)為是利用有活力的人造組織來(lái)修復(fù)機(jī)體的缺損。理想的組織工程材料應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒性、組織相容性佳、可生物降解及促機(jī)體內(nèi)血管再生。而血管再生至今仍然是組織工程中具有挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域。膠原作為動(dòng)物界分布最廣的細(xì)胞外物質(zhì)，具有高度的組織相容性，體內(nèi)無(wú)毒且可生物降解。肝素作為療效確切的抗凝藥物，也具有調(diào)節(jié)血管再生作用，此外，許多促血管再生的生長(zhǎng)因子(rhVEGF165、bFGF等)與肝素具有親和力。據(jù)此，應(yīng)用交鏈劑EDC/NHS將肝素共

2、價(jià)結(jié)合至膠原內(nèi)，然后再以促血管再生生長(zhǎng)因子rhVEGF與之生理性結(jié)合。另外，益氣活血類中藥也具有促血管再生療效，且價(jià)格經(jīng)濟(jì)、易于保存、消毒，故將中藥黃芪植入修飾后膠原內(nèi)，通過(guò)雞胚尿囊膜模型探查其促血管再生療效。 方法：試驗(yàn)用膠原由Dr.SnwelackSkin&HealthCareAG公司友情提供，被制成5×5×5mm(3.8～4.2mg)或直徑為10mm，厚度為2mm的圓片(3.8～4.2mg)大小。肝素通過(guò)交鏈劑EDC/NH

3、S共價(jià)結(jié)合至膠原內(nèi)。首先肝素內(nèi)的羧基團(tuán)被交鏈劑EDC/NHS(EDC：NHS固定為1∶0.6)活化，EDC/NHS與肝素的比值從0.2到4，反之亦然。活化后，膠原參與結(jié)合反應(yīng)，共4小時(shí)，然后充分洗滌出交鏈劑EDC/NHS，洗滌后，膠原予以冷凍(-80℃)后凍干備用。以Toludineblue法測(cè)定膠原內(nèi)肝素結(jié)合量，TNBS法測(cè)定自由氨基團(tuán)數(shù)量，膠原酶法測(cè)定其體外降解率，吸濕法測(cè)定其親水性，ELISA及放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定VEGF及肝素

4、的體外降解率。 修飾后的膠原載入rhVEGF及黃芪通過(guò)CAM以檢測(cè)其促血管再生能力。其方法為定量測(cè)定膠原周圍尿囊膜內(nèi)微血管數(shù)。分光光度法測(cè)定其血紅蛋白含量。測(cè)定取出標(biāo)本之干重。病理切片免疫組化標(biāo)記膠原內(nèi)再生血管情況。 結(jié)果：1修飾后膠原的理化性質(zhì)1.1肝素共價(jià)結(jié)合至膠原的量及修飾后膠原的親水性隨EDC/NHS與肝素的比值增加而上升，而其體外降解率及自由氨基團(tuán)數(shù)目卻隨之降低。增加參與修飾肝素的濃度并不能提高肝素的結(jié)合率，卻

5、提高修飾后膠原的體外降解率。 1.2肝素修飾后的膠原可以導(dǎo)致VEGF與之發(fā)生生理性結(jié)合，結(jié)合后可體外緩慢釋放21天，其釋放率與肝素降解一致，且由膠原酶降解而決定。 1.3VEGF載入肝素修飾后的膠原內(nèi)產(chǎn)生3種結(jié)合方式：a.以游離方式聚于膠原內(nèi)氣孔(10﹪～20﹪)；b.與膠原纖維發(fā)生非特異性結(jié)合(20﹪～30﹪)；c.與肝素發(fā)生生理性結(jié)合(50﹪～70﹪)。 2促血管再生作用2.1所有修飾后膠原植入雞胚后，與空白

6、組相比雞胚死亡率不增加，說(shuō)明無(wú)毒性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)+結(jié)果也提示無(wú)細(xì)胞毒性。 2.2大體標(biāo)本觀察，修飾后膠原(載入VEGF或黃芪)，血管生成呈“輪輻”狀朝向標(biāo)本生長(zhǎng)，體內(nèi)標(biāo)本降解率與體外降解率一致，修飾后的膠原組織相容性更佳。 2.3隨著肝素結(jié)合膠原內(nèi)量的增加，雞胚內(nèi)微血管再生數(shù)及血紅蛋白量增加，干重增加。 2.4VEGF及中藥黃芪載入修飾后膠原，產(chǎn)生了更強(qiáng)的血管再生作用，盡管機(jī)理不同，但是中藥黃芪可以達(dá)到與VEGF相似

7、的效應(yīng)。 2.5同時(shí)載入VEGF及黃芪至修飾后的膠原內(nèi)，可以產(chǎn)生協(xié)同促血管生長(zhǎng)作用的趨勢(shì)。 結(jié)論：1.本研究修飾后的膠原中肝素的結(jié)合量、體外降解率、親水性均可通過(guò)修飾反應(yīng)而控制，rhVEGF與之發(fā)生生理性結(jié)合后，可以產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)21天的持續(xù)釋放。中藥亦可載入修飾后的膠原內(nèi)，且該膠原無(wú)毒副作用，組織相容性佳，是組織工程中理想的促血管再生生物材料。 2.VEGF及中藥黃芪注射液載入修飾后膠原后，其促血管再生作用增強(qiáng)，中藥