甲狀腺乳頭狀癌浸潤前沿癌細(xì)胞極性喪失-粘附性下降與periostin的表達(dá)及臨床預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、背景與目的: 甲狀腺乳頭狀癌是人體最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤。甲狀腺癌患者的預(yù)后較好，術(shù)后10年無病生存率約為90％，但仍有10％的患者出現(xiàn)術(shù)后癌復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移甚至因癌死亡。研究表明，手術(shù)時(shí)甲狀腺外浸潤的出現(xiàn)與患者術(shù)后的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，發(fā)現(xiàn)影響甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展和浸潤的分子水平的變化，對甲狀腺乳頭狀癌的治療具有重要應(yīng)用意義。 最近，一個(gè)新基因periostin，又稱osteoblast specific protei

2、n2（OSF-2）被連續(xù)報(bào)道在一系列癌的生長，血管生成，浸潤及轉(zhuǎn)移中起重要角色，包括甲狀腺乳頭狀癌。在乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞及小鼠種植瘤實(shí)驗(yàn)中，periostin的高表達(dá)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子2的高表達(dá)，從而推動(dòng)癌的進(jìn)展和血管生成；在肺非小細(xì)胞癌中，患者血清中periostin的高水平與不良臨床預(yù)后之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在甲狀腺乳頭狀癌組織中，periostin的高表達(dá)與癌的甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌的高進(jìn)展階段相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將per

3、iostin基因?qū)氲?93T癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而侵襲活性增強(qiáng)。有報(bào)道表明，在鱗狀細(xì)胞癌培養(yǎng)細(xì)胞中，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型的癌細(xì)胞，其periostin的表達(dá)量遠(yuǎn)高于上皮表型的癌細(xì)胞。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化是癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)普遍現(xiàn)象，其特征為浸潤前沿部癌細(xì)胞上皮特性的喪失和間質(zhì)特性的獲得，包括形態(tài)學(xué)方面癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降，及分子水平E-cadherin表達(dá)下降，vimentin、上皮生長因子受體、間質(zhì)金

4、屬蛋白酶-9、TGF-β、NFkβ表達(dá)上調(diào)等。然而，在甲狀腺乳頭狀癌中，作為上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)特征的癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降與其他臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，包括與甲狀腺外浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍然未知；與periostin表達(dá)的關(guān)系也依然未知。 到目前為止，人體組織中periostin共有五種isoform被報(bào)道。這五種isoform的差異位于外顯子XV1-XX11（對應(yīng)于periostin蛋白的C端），由轉(zhuǎn)錄水平mRNA的

5、選擇性剪接（alternative splicing）造成。在膀胱癌組織和正常組織中，有不同的periostin isoform表達(dá)，因此periostin isoform的表達(dá)方式被認(rèn)為與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)。periostin isoform在甲狀腺組織，包括癌組織和非癌組織中的表達(dá)尚未有道。 本研究擬解決以下幾個(gè)問題：（1）甲狀腺乳頭狀癌浸潤前沿癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降與其它臨床病理學(xué)指標(biāo)（性別、年齡、癌的大小、甲狀腺外

6、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）的關(guān)系及其對臨床預(yù)后的影響。（2）甲狀腺乳頭狀癌浸潤前沿癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降與periostin表達(dá)的關(guān)系。（3）periostin isoform在甲狀腺癌組織及非癌組織中的表達(dá)方式及其與甲狀腺癌的發(fā)生或發(fā)展的關(guān)系。 方法: 1．將68例甲狀腺乳頭狀癌癌組織及其周圍組織用甲醛固定，石蠟包埋，制成HE切片，檢測浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的情況，并用X2檢驗(yàn)或Fisher's精確

7、概率檢驗(yàn)檢測其與其它臨床病理學(xué)指標(biāo)（性別、年齡、癌的大小、甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）的關(guān)系。 2．提取1中所述病例的甲狀腺癌組織及其背景甲狀腺非癌組織的全RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR法檢測是否有periostin表達(dá)。用Taqman的探針和引物，采用real-time PCR法檢測periostin在甲狀腺組織的定量表達(dá)。β-actin為內(nèi)對照。periostin在甲狀腺乳頭狀癌癌組織和對應(yīng)的非癌組織中的差異用△△

8、Ct法計(jì)算，表示為T/N比（T：癌組織；N：非癌組織）。用X2檢驗(yàn)或Fisher's精確概率檢驗(yàn)檢測periostin的表達(dá)與浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降及其它臨床病理學(xué)指標(biāo)（性別、年齡、癌的大小、甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）的關(guān)系。 3．設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增periostin cDNA全長的幾對引物，通過RT-PCR法獲得擴(kuò)增的目的DNA片段，并用瓊脂糖凝膠跑電泳。將同一膠上不同長度的DNA目的片段分離，純化，用DNA測序

9、法檢測periostin isoform在甲狀腺癌組織、非癌組織及癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并檢測periostin isoform的表達(dá)方式與甲狀腺癌的發(fā)生或癌的進(jìn)展有無關(guān)聯(lián)。 4．對181例有臨床預(yù)后資料的甲狀腺乳頭狀癌患者（癌直徑<10mm或手術(shù)時(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的除外）進(jìn)行回顧性分析，調(diào)查手術(shù)時(shí)患者的基本情況以及癌的臨床病理學(xué)指標(biāo)，包括性別、年齡、癌的大小、有無甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pT（UICC的TNM分類）、stage g

10、rouping（UICC的TNM分類）、手術(shù)斷端有無癌等。閱覽手術(shù)切除標(biāo)本的HE切片，觀察浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的情況。用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)檢測浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的情況對患者無病生存率的影響，以及各個(gè)臨床病理學(xué)指標(biāo)在單因素生存分析中的意義。對在單因素分析中有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。 結(jié)果: 1．68例甲狀腺乳頭

11、狀癌中，浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降陽性的病例為42例（61．8％）。癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降與癌的甲狀腺外浸潤（P=0．0085），pT高值（P=0．0437）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0．0015）呈正相關(guān)；與患者的年齡，性別及腫瘤大小之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 2．periostin的表達(dá)用T/N比表示，以T/N=4為臨界值，在68例甲狀腺癌患者中有26例（38．2％）患者T/N>4，有42例（61．8％

12、）患者T/N≤4。Periotin的高表達(dá)（T/N>4）與癌浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．0001）；Periotin的高表達(dá)（T/N）4）與癌的甲狀腺外浸潤（P=0．0005），pT高值（P=0．0015）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0．0246）呈正相關(guān)。 3．在人體甲狀腺非癌組織、乳頭狀癌組織、濾泡癌組織、未分化癌組織、乳頭狀癌培養(yǎng)細(xì)胞、濾泡癌培養(yǎng)細(xì)胞及未分化癌培養(yǎng)細(xì)胞中，periostin is

13、oform的表達(dá)方式相同，都有8個(gè)isoform被表達(dá)。其中5個(gè)isoform已被報(bào)道，3個(gè)是新發(fā)現(xiàn)。這8個(gè)isoform與野生型periostin相比，在外顯子XVⅡ～XXⅠ中有選擇性序列缺失，但這些序列缺失并未引起讀碼框的移動(dòng)。3個(gè)新isoform的特點(diǎn)分別為外顯子XVⅡ+XVⅢ，XVⅡ+XXⅠ，XVⅡ+XVⅢ+XIX全部核苷酸序列的缺失。它們的cDNA序列已被基因庫（Genbank）收錄，編碼為：EU262883，EU262884

14、和EU262886。3個(gè)新isoform中有兩個(gè)之前未在任何種類和任何組織中被報(bào)道。 4．在181例甲狀腺乳頭狀癌患者中，癌浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的陽性率為71．0％，他們的隨訪時(shí)間為131±47（mean±s．d．）月。Kaplan-Meier生存曲線及l(fā)og-rank檢驗(yàn)顯示浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的出現(xiàn)與不良臨床預(yù)后成正相關(guān)（P=0．0229）。同時(shí)，結(jié)果1中浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或

15、粘附性下降與癌的甲狀腺外浸潤，pT高值及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系用這批病例得到了又一次驗(yàn)證。 5．在單因素分析中，浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降、患者年齡、腫瘤大小、甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pT、stage grouping及手術(shù)斷端是否陽性對患者的無病生存有顯著性影響：在多因素分析中，只有患者年齡和肉眼淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者無病生存的獨(dú)立變量。 結(jié)論: 1．在人體甲狀腺乳頭狀癌中，作為癌上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)

16、特點(diǎn)的浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的出現(xiàn)與參與癌上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的分子periostin的高表達(dá)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降的出現(xiàn)與癌的甲狀腺外浸潤，pT高值及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。生存分析顯示，浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降陽性的患者其無病生存率明顯低于陰性患者。本研究有效地闡述了甲狀腺乳頭狀癌中periostin的表達(dá)，浸潤前沿部癌細(xì)胞極性缺失和/或粘附性下降這一形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，