核受體RXRγ的表達與上皮-間葉轉(zhuǎn)化及甲狀腺乳頭狀癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、背景：甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinora，PTC)是人類最常見的內(nèi)分泌腫瘤。甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后良好，但仍有10％的病人發(fā)生淋巴結(jié)復(fù)發(fā)或者遠處器官的轉(zhuǎn)移。盡管乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率很高，但能夠從腫瘤獲得并用于提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標尚未得到廣泛認識。前期研究主要關(guān)注于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其在促進血管生成與淋巴管生成中的作用。最近，

2、在胚胎發(fā)育過程中發(fā)展起來的上皮-間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，被報道在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重大作用。上皮-間葉轉(zhuǎn)化是在胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的。1982年，Gary Greenburg發(fā)現(xiàn)在三維立體膠中培養(yǎng)的角膜上皮細胞可以轉(zhuǎn)化為具有遷移能力的間葉組織，首次提出EMT的概念。組織學(xué)上，EMT表現(xiàn)為上皮極性和細胞間黏附缺失。在分子水平上，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)粘附蛋白失表達，如E-cadh

3、erin和β-catenin；并獲得間葉組織標記的表達，如vimentin和fibronectin。并且，上皮來源的腫瘤細胞向間質(zhì)性細胞轉(zhuǎn)換以獲得向間質(zhì)侵襲的能力。因而，EMT在上皮性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用。某些逆轉(zhuǎn)上皮-間葉轉(zhuǎn)化的化合物可抑制腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移、改善病人的預(yù)后和生存質(zhì)量。迄今為止，EMT被報道與多種腫瘤的高轉(zhuǎn)移率相關(guān)，包括前列腺癌、乳腺癌、小細胞肺癌和直腸結(jié)腸癌。在甲狀腺癌，我們最先提出了腫瘤浸潤前沿細胞極性

4、/粘附性消失的概念(loss of cellular polarity/cohesiveness，LOP/C)，表現(xiàn)為腫瘤細胞聯(lián)系松散、單個排列，未能形成典型的乳頭狀、濾泡狀結(jié)構(gòu)。進一步研究表明，伴有LOP/C的甲狀腺乳頭狀癌，更容易發(fā)生甲狀腺外浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；LOP/C成分不少于20％的PTC被證明為具有高復(fù)發(fā)率的中分化甲狀腺乳頭狀癌。根據(jù)以上闡述的EMT的特征，占有腫瘤組織相當(dāng)數(shù)量的這部分伴有LOP/C的腫瘤細胞，可以從組織學(xué)上解

5、釋為上皮一間葉轉(zhuǎn)化。Vasko et al的研究同樣發(fā)現(xiàn)，在細胞間黏附和溝通中發(fā)揮重要作用的蛋白，在甲狀腺乳頭狀癌浸潤前沿的mRNA表達降低，但Vimentin的表達升高。Asioli et al的最新研究也表明，這類腫瘤具有侵襲性行為和較高的死亡率。核受體(Nuclear receptors，NRs)是受一系列親脂類配體調(diào)節(jié)，這類配體包括類固醇、甲狀腺激素、維甲酸和維生素D3。核受體通過與配體的結(jié)合來發(fā)揮基因活化和翻譯后的重要步驟，如

6、磷酸化。并通過與多種信號傳導(dǎo)通路的相互作用來實現(xiàn)其功能，如MAPK phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K/Akt)和Wnt信號傳導(dǎo)通路。視黃醛衍生物通過與維甲酸受體的結(jié)合對腫瘤細胞生長和分化發(fā)揮作用，包括維甲酸受體(PARs)和維甲酸X受體(RXRs)。RXRγ是一種維甲酸x受體，有兩種異構(gòu)體，包括α和β。迄今為止，有關(guān)維甲酸受體在甲狀腺腫瘤組織和細胞系中的表達已有各種各樣的報道。前期研究表明，RARs在

7、大部分甲狀腺乳頭狀癌中失表達，但與非腫瘤甲狀腺組織相比，9例甲狀腺癌中有7例高表達RXRγ mRNA，這一結(jié)果后來得到許多其他研究者的支持。同時，RXRγ的異常表達被證明與胰腺高分化內(nèi)分泌腫瘤的高轉(zhuǎn)移率有關(guān)。然而，RXRγ的在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其生物學(xué)作用尚未明了。
　　 目的：①甲狀腺乳頭狀癌中RXRγ mRNA及其蛋白的表達：②RXRγ的表達與臨床病理資料的關(guān)系；③)甲狀腺乳頭狀癌浸潤前沿細胞極性/粘附性消失的臨床病理

8、學(xué)特點及其免疫組織化學(xué)特征；④甲狀腺乳頭狀癌中上皮-間葉轉(zhuǎn)化概念的提出。
　　 方法：⑴將69例甲狀腺乳頭狀癌癌組織及其周圍組織用甲醛固定，石蠟包埋，制成HE切片，檢測浸潤前沿部癌細胞極性缺失和/或粘附性下降的情況，并用卡方檢驗或Fisher’s精確概率檢驗檢測其與其它臨床病理學(xué)指標(性別、年齡、癌的大小、甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)的關(guān)系。⑵提取所有病例的甲狀腺癌組織及其配對甲狀腺非腫瘤組織的全RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT

9、-PCR法檢測是否有RXRγmRNA的表達。用Taqman的探針和引物，采用real-time PCR法檢測RXRγ mRNA在甲狀腺組織的定量表達，β-actin為內(nèi)對照。RKRγ mRNA在甲狀腺乳頭狀癌癌組織和對應(yīng)的非癌組織中的差異用△△Ct法計算，表示為T/N比(T：腫瘤組織：N：非腫瘤組織)。用卡方檢驗或Fisher’s精確概率檢驗檢測RXRγ mRNA的表達與浸潤前沿腫瘤細胞極性缺失和/或粘附性下降，及其它臨床病理學(xué)指標(性

10、別、年齡、癌的大小、甲狀腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等、脈管浸潤、是否復(fù)發(fā))的關(guān)系。⑶選取4例高表達RXRγ mRNA的甲狀腺腫瘤組織及其配對非腫瘤組織，提取各組織中的蛋白質(zhì)，進行蛋白印跡染色，并對腫瘤與非腫瘤組織中的表達進行比較。⑷選取13例高表達RKRγmRNA的病例，進行RXRγ免疫組織化學(xué)染色；另外選取16例具有一定成分LOP/C(20％)的病理，進行TTF-1，E-cadherin，β-catenin和vimentin的免疫組織化學(xué)染

11、色；分別對各自的免疫組織化學(xué)特點進行病理學(xué)分析。⑸分析LOP/C的免疫組織化學(xué)特色，并檢測其與其他臨床病理學(xué)指標的關(guān)系。⑹用逐步logistic regression分析檢測可能導(dǎo)致甲狀腺腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的危險因子。
　　 結(jié)果：①按照2004年內(nèi)分泌腫瘤的WHO分類和UICC腫瘤分期，采用雙盲法對所有標本的HE切片進行觀察總結(jié)。低分化甲狀腺癌和硬化型PTC被從本研究中剔除。②LOP/C位于甲狀腺乳頭狀癌腫瘤浸潤前沿。69例甲狀腺

12、乳頭狀癌中，有42例(61.896)為癌浸潤前沿癌LOP/C比例不少于20％，定為陽性組；27例(38.2％)為少于20％，定為陰性組。③采用公式2exp(△Ct tumpor-△Ct normal)計算RXRγ在甲狀腺乳頭狀癌腫瘤組織及其對應(yīng)的甲狀腺非腫瘤組織中的表達差異，并用△△Ct進行表示。以T/N比等于1.5為臨界值，在69例甲狀腺乳頭狀癌中，有59例(85.5％)表達上調(diào)，10例(15.5％)表達下調(diào)。甲狀腺乳頭狀癌中RXRγ

13、 mRNA的高表達具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)。40例(95.2％)伴有LOP/C的腫瘤高表達RXRγ表達上調(diào)與癌浸潤前沿癌LOP/C陽性之間有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.345，P=0.004)。統(tǒng)計學(xué)研究結(jié)果表明，RXRγ表達上調(diào)的PTC患者，在手術(shù)時更容易伴發(fā)甲狀腺外浸潤(r=0.292，P=0.019)、進展期腫瘤(pT3和pT4，r=0.318，P=0.016)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.338，P=0.005)；RXRγ高表達

14、與患者年齡、性別、腫瘤大小及臨床病理學(xué)分期無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。免疫組織化學(xué)研究表明，非腫瘤甲狀腺組織低表達或者不表達，而在甲狀腺癌中呈彌漫粗顆粒狀表達。LOP/C中RXRγ蛋白的表達略有升高。值得注意的是橋本甲狀腺炎的甲狀腺濾泡細胞漿中，RXRγ表達明顯升高。④伴有LOP/C的腫瘤細胞的免疫學(xué)特點與同一病例中未伴有LOP/C的腫瘤細胞進行了比較。相比經(jīng)典型PTC腫瘤細胞核中TTF-1的高表達，16例甲狀腺癌中伴有LOP/C的腫瘤細胞均傾向于

15、不同程度低表達TTF-1、或者失表達。伴有LOP/C的腫瘤細胞膜E-cadherin表達減少，而β-catenin在細胞膜上的表達下降，而在細胞漿和細胞核內(nèi)的表達升高。經(jīng)典型PTC的vimentin主要表達于細胞漿靠近基底膜側(cè)，而伴有LOP/C的腫瘤細胞則呈廣泛強陽性。⑤逐步Logistic回歸分析進一步表明，RXRγ高表達是手術(shù)時甲狀腺乳頭狀癌高發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個獨立因子之一。RXRγ高表達的腫瘤手術(shù)時伴發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率是其他腫瘤的

16、6倍。此外，伴有LOP/C的甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是無LOP/C的8倍，而甲狀腺外浸潤(OR，8.759)和進展期(OR，6.143)甲狀腺乳頭狀癌均被證明為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立因子。
　　 結(jié)論：⑴癌浸潤前沿癌LOP/C同時與甲狀腺外浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而甲狀腺外浸潤與甲狀腺乳頭狀癌術(shù)后復(fù)發(fā)高度相關(guān)，提示癌浸潤前沿癌LOP/C可以作為一個組織病理學(xué)指標對腫瘤進行預(yù)后分析。由于在甲狀腺乳頭狀癌中，RXRγ的高表達與甲狀腺外浸潤

17、有顯著性關(guān)聯(lián)，阻斷RXRγ的高表達可以作為治療侵襲性甲狀腺乳頭狀癌的一個指標。⑵LOP/C的免疫組織化學(xué)特征表明，其低表達、或者不表達、或異常表達上皮細胞粘附分子標記物E-cadherin和β-catenin、及間葉組織標記物vimentin，我們因之推測LOP/C的細胞分化程度降低、上皮細胞特性減弱、間質(zhì)細胞特性增強。該形態(tài)主要見于腫瘤浸潤前沿，且與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)均呈相關(guān)性。所以，我們認為LOP/C是上皮-間葉轉(zhuǎn)化的一個形態(tài)學(xué)表