氯化錳與LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用與機(jī)制研究.pdf

1、現(xiàn)代社會(huì)中，錳元素被廣泛用于冶金、電池以及殺蟲(chóng)劑等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，特別是作為新一代的汽油防爆劑使用，使得環(huán)境中錳的含量逐漸升高，錳的毒性危害也日益受到人們的重視。研究表明，長(zhǎng)期接觸錳元素能夠引起基底神經(jīng)節(jié)和錐體外系統(tǒng)的神經(jīng)毒性，并且能夠增加帕金森疾病的發(fā)病幾率。 目前為止，錳對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用機(jī)制尚不十分清楚。以往對(duì)錳神經(jīng)毒性的研究，主要關(guān)注錳對(duì)神經(jīng)元的直接損傷和對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響上，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用卻一

2、直被忽視。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)具有巨噬細(xì)胞類(lèi)似功能的非特異性免疫細(xì)胞，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能中發(fā)揮重要作用。過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的神經(jīng)毒性因子，如一氧化氮(NO)、活性氧簇(ROS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL—6)，以及谷氨酸(Glu)等興奮性氨基酸，可誘發(fā)或參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。因此，本論文以NO、Glu和胞內(nèi)ROS為檢測(cè)指標(biāo)，考察了氯化錳(MnCl2)單獨(dú)作用和與細(xì)菌脂

3、多糖(LPS)聯(lián)合作用對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，并進(jìn)行相關(guān)的機(jī)制探討；還考察了米諾環(huán)素等四種單體化合物對(duì)MnCl2誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的影響，為研究錳神經(jīng)毒性的機(jī)制和臨床藥物干預(yù)提供理論依據(jù)。 首先，MTT的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MnCl2(300、1000μM)影響N9小膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)選用MnCl2(10、30、100μM)進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。接著，運(yùn)用Griess法檢測(cè)MnCl2對(duì)N9細(xì)胞NO釋放的影響，結(jié)果顯示單獨(dú)MnCl2不

4、能引起N9細(xì)胞NO的釋放，但是能顯著增加LPS誘導(dǎo)的N9細(xì)胞NO釋放。說(shuō)明MnCl2對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的增加，需要小膠質(zhì)細(xì)胞的活化為前提。10ng/mL的LPS對(duì)N9細(xì)胞NO的釋放沒(méi)有影響，但與MnCl2合用后，能夠顯著刺激N9細(xì)胞釋放NO，說(shuō)明MnCl2能夠使閾下濃度的LPS誘導(dǎo)N9細(xì)胞釋放NO。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，提前給予LPS3h不能使單獨(dú)的MnCl2具有刺激N9細(xì)胞釋放NO的能力；但是提前給予MnCl23h，LPS對(duì)N9細(xì)胞的NO釋放

5、比單獨(dú)LPS刺激的NO釋放量高。 采用原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，MnCl2單獨(dú)作用，不能增加大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放，但是能顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放。這些結(jié)果都與MnCl2作用于N9小膠質(zhì)細(xì)胞系的結(jié)果一致。 采用高效液相結(jié)合熒光檢測(cè)器的方法研究了MnCl2和MnCl2+LPS兩種模型活化N9細(xì)胞釋放谷氨酸(Glu)水平的變化。首次發(fā)現(xiàn)了MnCl2能夠刺激N9細(xì)胞釋放谷氨酸，此作

6、用可被谷氨酸/胱氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Xc轉(zhuǎn)運(yùn)體)的抑制劑L-α—aminoadipicacid(AAA)顯著抑制。并且，MnCl2和LPS聯(lián)合作用對(duì)N9細(xì)胞谷氨酸的釋放有協(xié)同增加作用。本文進(jìn)一步研究了MnCl2促進(jìn)N9細(xì)胞谷氨酸釋放的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MnCl2作用N9細(xì)胞早期，能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量以及降低細(xì)胞內(nèi)GSH水平?？寡趸瘎㎞AC不但能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，提高細(xì)胞內(nèi)GSH水平，而且能夠明顯抑制MnCl2刺激的谷氨酸釋放。RT

7、-PCR的結(jié)果也證實(shí)，MnCl2能夠顯著增加小膠質(zhì)細(xì)胞Xc轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明，小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和Xc轉(zhuǎn)運(yùn)體的激活可能均參與了氯化錳誘導(dǎo)的N9細(xì)胞谷氨酸的釋放。 最后，本文考察了藥物對(duì)MnCl2+LPS和LPS刺激N9細(xì)胞NO釋放的抑制作用。結(jié)果表明，米諾環(huán)素，姜黃素以及白藜蘆醇對(duì)兩種模型都具有顯著的抑制作用，但對(duì)兩種模型的抑制率存在差異，可能是因?yàn)樗幬镆种菩∧z質(zhì)細(xì)胞活化的主要分子靶點(diǎn)不同決定的。 綜上